mTORC1/ PGC-1α通路在高脂肪酸损伤卵母细胞线粒体活性及代谢中的作用和机制

Women adiposity not only reduces oocyte and embryo development potential, but also leads to increased risk of metabolic disorders in offspring adulthood. Its mechanism is indefinite. Our previous study found that high free fatty acid (FFA) concentration in follicular fluid impaired embryonic development potential, involving abnormal expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ co-activator 1α (PGC-1α). PGC-1α is an important molecular in regulation of mitochondrial function and activity, responding to cellular energy metabolism stress in some energy consuming organizations that is regulated by upstream regulator—mammalian Target of Rapamycin Complex 1（mTORC1）. However, its roles in oocytes and embryos have not been reported. Based on our pre-clinical and basic research results, this study was intended to explore the effect of mTORC1 / PGC-1α on regulation of oocyte / embryo mitochondrial activity and metabolism under high FFA microenvironment. We will use mouse oocytes/embryos as research materials to study the mechanisms from pros and cons sides, applying the technological means of effect blocking, over expression and silencing tactics. Also, we will explore the signaling pathway included in the process through signaling pathway array. After that, we plan to verification some results from mouse model in human embryos which are donated by patients receiving in vitro fertilization cycles. The research will provide therapeutic targets for improving embryo development potential and progeny life quality of obese women, but also provide important clues for basic researches on regulation of mitochondrial activity in oocyte and embryo.

女性肥胖不仅降低生殖能力，还导致子代成年后代谢紊乱风险增加，机制不明。我们前期研究发现卵泡液高游离脂肪酸环境降低胚胎发育潜能，涉及过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)表达的改变。PGC-1α是调控线粒体功能的重要分子， 受雷帕霉素靶基因蛋白复合物1（mTORC1）调节，应对细胞能量变化而调控线粒体活性和代谢，但二者在卵母细胞和胚胎中的作用从未见报道。本研究立足前期临床和基础研究，拟以小鼠卵母细胞和胚胎为研究材料，采用效应阻断、过表达及沉默策略，首次探讨mTORC1/PGC-1α在高脂肪酸环境下对卵母细胞/胚胎线粒体活性和代谢的调控作用，寻找作用信号通路；同时利用体外助孕周期患者捐赠人胚胎验证部分小鼠实验结果。 研究将为改善肥胖女性胚胎发育潜能及提高子代生存质量提供治疗靶点，还将为揭示卵母细胞及胚胎线粒体活性调控的基础研究提供重要线索。

8周小鼠进行高脂饲料饲养4周后发现，卵母细胞超微结构中见巨大脂肪滴比例增加，多量线粒体膜表现为模糊不清，线粒体嵴散乱，偶见断裂的线粒体分布在胞浆中。细胞基质有空泡出现，并形成有线粒体空泡复合体。说明高脂肪酸环境损伤卵母细胞线粒体结构。通过转录组测序发现，高脂小鼠与对照小鼠卵母细胞在甾体激素合成以及游离脂肪酸代谢通路是差异基因最多的。在女性IVF助孕周期中，以卵泡液FFA0.40 为标准，筛选高FFA组女性14例，对照组女性12例， 取卵时将颗粒细胞收集纯化，进行基于Thermo Q Exactive TM系列高分辨质谱仪，进行蛋白质组测序并采用相关软件进行分析。我们发现卵子成熟相关基因INSL3,YUBB8的表达在FFA升高女性组都是表达增加的，推测可能与卵母细胞发育迟滞的补偿性机制有关。GO及KEGG通路分析显示，能量代谢通路（包括氧化磷酸化、产热与碳水化合物代谢） 、细胞基质连接蛋白（受体关联、局部黏附与细胞骨架调节）、 甾体激素合成、糖类残基代谢通路、凋亡、 PI3K-AKT 信号通路、 松弛素信号通路等是差异蛋白表达最多的。为验证蛋白组学结果，我们检测了两组人颗粒细胞（hGC）中代谢相关基因的mRNA表达,发现FFA水平高的女性hGC中，TRIB3基因的mRNA表达显着较高而FSHR的mRNA水平 下调 ，CYP17A1和CYP19A1的mRNA表达水平的变化不显着 。在体外培养的高FFA模型的hGC中，可以清楚地观察到Akt /GSK3β信号失调。 我们敲低了TRIB3，发现TRIB3敲低逆转了PA诱导的p-Akt下调及p-GSK3β表达上调， 添加P529处理后，p-AKT的表达降低 而p-GSK3β上调。AKT抑制剂Per529（Ser473）刺激后发现，FSHR的mRNA和蛋白表达水平增加，P529可以逆转这种增加 。 我们又比较了不同组之间细胞培养上清液中E2的浓度。 当用PA处理时，FSH刺激下颗粒细胞产生的E2水平会降低， TRIB3敲低可以逆转这种降低，而P529可以增加这种降低幅度。.因此，高脂肪酸环境对于卵母细胞主要的影响表现在线粒体结构受损，而功能方面主要表现为颗粒细胞在FSH刺激下甾体激素生成障碍，与胰岛素抵抗关键基因TRIB3表达水平有密切关联。