低氧介导内质网应激调控牙髓干细胞成牙本质分化及其机制

Hypoxia usually occurs in the process of raparative dentinogenesis, when dental pulp suffers from inflammation or injury.Endoplasmic reticulum （ ER ）stress which is an important cell's response to stress, is proved to regulate cell's life activity in hypoxia and osteoblast's differentiation and bone formation. In our previous study, we found that hypoxia promoted the odontogenic differentiation of dental pulp cells. In the meantime, ER stress level of dental pulp cells was increased by hypoxia. It is well known that odontogenic differentiation is similar to osteoblast differentiation. Therefore, we hypothesize that hypoxia mediated ER stress regulates dental pulp stem cell(DPSC)'s odontogenic differentiation. To prove this hypothesis, shRNA and gene overexpression technologies will be used to down or up cells' ER stress levels and DPSC's odontogenic differentiation will be detected in hypoxia condition. Moreover, the interaction between ER stress and odontogenic differentiation markers, which can explore the mechanism preliminarily, will be investigated by some techniques such as biological information technology, chromatin immunoprecipitation and luciferase reporter system. Meanwhile, gene modified cells will be combined with the scaffold biomaterials to detect the cells'odontogensis ability in vivo. Above all, the goal of this study is to confirm that hypoxia mediated ER stress regulates DPSC's odontogenic differentiation, which will enrich the theroies of DPSC's odontogenic differentiation and provide new strategy for therapies of dental pulp conservation .

牙髓组织受到炎症损伤后，修复性牙本质形成过程常伴有低氧。内质网应激是细胞面对应激的适应性反应，有研究证明低氧时细胞通过内质网应激调控生命活动并参与成骨细胞分化和骨形成。课题组前期发现低氧促进牙髓细胞成牙本质分化，并上调内质网应激水平。牙髓干细胞成牙本质分化与成骨细胞分化相似，因此推测低氧介导内质网应激参与调控牙髓干细胞成牙本质分化，这可能是牙髓干细胞分化的一个新机制。为证实此假设，拟运用RNA干扰/基因过表达关键信号分子下调/上调内质网应激，检测低氧时牙髓干细胞成牙本质分化情况；并利用生物信息技术、染色体免疫共沉淀和荧光素酶报告基因系统等探讨低氧时内质网应激关键信号分子与成牙本质分化标志分子的相互作用，初步阐明其分子机制。同时将基因修饰细胞与生物支架材料复合观察体内牙本质形成能力，进一步明确内质网应激调控牙髓干细胞成牙本质分化，从而丰富牙髓干细胞分化理论，以期为活髓保存治疗提供新策略。

目的：牙髓组织受到炎症损伤后，修复性牙本质形成过程常伴有低氧。课题组前期发现低氧促进牙髓细胞（DPCs）成牙本质分化，并上调内质网应激(ERS)水平。根据前期结果和文献回顾，我们推测低氧介导内质网应激参与调控牙髓干细胞成牙本质分化。这将是牙髓细胞分化的一个新机制。为证实此假设，我们进行本课题的研究。 材料和方法：1.用5% O2作用DPCs不同作用时间后检测ERS水平，衣霉素作为ERS阳性对照。 2.选取表达明显的ERS关键信号分子，构建PERK干扰慢病毒。PCR或WB检测干扰效果。 3.体外观察低氧作用PERK基因沉默前/后DPCs成牙本质分化能力的变化。4.观察低氧预处理的PERK基因沉默前/后DPCs体内形成牙本质样组织的情况。5.利用染色体免疫共沉淀探讨低氧作用时活化转录因子4（ATF4）与成牙本质分化标志分子的相互作用，初步阐明其分子机制。 结果：1.使用5% O2处理DPCs可以促进其增殖和矿化，检测ERS水平发现关键信号分子XBP1、GRP78和chop 转录上调。同时PERK蛋白磷酸化水平增高。处理48h时PERK-eIF2α-ATF4信号通路激活水平最高。 2.成功构建LV-PERK-RNAi慢病毒载体，病毒滴度为3×108 TU/ml,筛选最适MOI=30；RT-PCR和Western Blot检测显示，PERK基因的mRNA和蛋白质表达水平明显降低，表达抑制率约63%。 3. 用5% O2处理DPCs，可以在体外促进其成牙本质分化。干扰PERK基因后，低氧成牙本质促进作用被下调。 4.体内结果表明5% O2预处理DPCs并矿化诱导2w后，可以在体内形成更多的牙本质样组织。干扰慢病毒转染DPCs后几乎不能形成牙本质样组织。 5.CHIP结果显示，与常氧组对比，5% O2处理DPCs后ATF4与成牙本质分化基因（DSPP、OCN、BSP）启动子上游序列结合更多。 结论：1. 用5% O2处理DPCs存在ERS,48hP-PERK蛋白表达明显上调，PERK下游ATF4表达也上调。2.成功构建PERK干扰慢病毒（LV-PERK-RNAi）。 3.低氧可以在体外和体内促进DPCs成牙本质分化，干扰PERK基因后，低氧成牙本质分化的促进作用被下调。 4.ERS关键分子ATF4与矿化相关基因DSPP、OCN、BSP存在相互作用。