多糖电荷密度调控高压脉冲电场钝化α-淀粉酶的规律及机理研究

Researches have been done regarding the inactivation of enzyme by high voltage pulsed electric fields (HV-PEF). But the co-exist compositions (especially polysaccharides) in food matrix, which do not act as substrates, will interact with enzyme and affect the efficacy of inactivation. The regulation mechanism caused by the interaction of enzyme with non-substrate polysaccharides still remains unclear. In the present project, α-amylase is set as an enzyme model. In order to illustrate the inactivation effects and aggregation behavior of linear charge density of non-starch polysaccharides (including carrageenan, pectin, and chitosan) on α-amylase under the treatment of PEF, we will study the electrostatic interaction of enzyme and polysaccharide, self-assembly behavior, and structure of enzyme/polysaccharide complexes under PEF environment. The differences of interactions between enzyme and polysaccharide and complexes resulting from the charge density of polysaccharides will be investigated under various strengths of electric field. Accordingly, the relative enzyme activities are recorded for quantifying the relationship among charge density of polysaccharides, enzyme/polysaccharide complexation, and enzyme activities under PEF treatment. Results will provide parameters for inactivation of enzyme by PEF in food systems with complicated matrix, designing new food structure or ingredient, improving the efficiency of catalytic reactions, and reducing the cost of food processing.

高压脉冲电场广泛应用于钝化酶的研究，食品体系中非淀粉多糖能够与酶发生相互作用，进而影响到钝化效果。然而，此相互作用对钝化效果影响的规律及机制尚未得到揭示。本项目拟以α-淀粉酶为模型酶，研究不同电荷密度的非淀粉多糖（卡拉胶、果胶、壳聚糖）与α-淀粉酶在外加电场处理下相互作用的改变，探究二者静电复合化过程及复合物结构在电场下的变化规律，揭示电荷密度对α-淀粉酶活性、复合化聚集行为的影响，阐述非淀粉多糖电荷密度与高压脉冲电场钝化酶效果的构效关系。通过本研究试图揭示脉冲电场处理过程中，多糖电荷密度对酶活力的耦合影响规律，建立静电相互作用诱导酶活力变化的关联性，并阐明酶活力变化的结构基础。该研究对调控食品体系内的常温催化反应及脉冲电场工艺条件的筛选均具有十分现实的指导意义，并为提高加工效率和降低食品加工成本方面提供了重要的参考价值。

在高压脉冲电场（pulsed electric field, PEF）钝化食品酶的过程中，共存多糖与酶的静电相互作用会引起钝化效果的改变。本项目以粮食加工中常用的α-淀粉酶为模型，研究了不同电荷密度多糖与α-淀粉酶的相互作用及在外电场条件下自组装形成复合物的演变过程。结果显示，果胶和α-淀粉酶在pH 2.0-5.0存在相互作用，最佳结合比例为1:4；λ-卡拉胶与α-淀粉酶在pH<5.0范围内均具有强烈的相互作用，最佳结合比例为1:12。高电荷密度的λ-卡拉胶与α-淀粉酶静电结合能有效提升酶对酸、热的抗敏感度，有效保护酶活性位点不暴露。在电场强度20 kV/cm，脉冲宽度40 μs，频率1.06 kHz，循环5次处理时，α-淀粉酶能达到最佳钝化效果。PEF诱导α-淀粉酶失活的机制与酸、热引发的不同，外电场改变α-淀粉酶表面电荷分布、偶极矩，诱导α-淀粉酶内源荧光猝灭，色氨酸微环境改变，疏水内核外翻，使酶活性位点更易暴露。此外，在PEF钝化酶的过程中，观察到了中间熔球态的存在。当α-淀粉酶与多糖形成静电复合物，复合物颗粒在外电场中发生极化，在周围产生了一个偶极场，各向异性使得其在沿电场方向上具有两两吸引力。此外，根据双电层理论，当施加外电场时，复合物表面的正电荷向阴极移动，双电层中的负电荷向阳极移动，在脉冲周期内，电场方向快速变化，表面电荷的快速旋转使得相邻两个复合物颗粒沿电场相反的方向移动，最终导致颗粒连接形成团簇、线状、分枝或微胶囊的形状。在高外电场作用下，最终钝化酶的效果取决于流体在处理室内的流体场、平行板电极产生的电场和欧姆热产生的热场等多场强耦合作用。复合物形态变化也归因于非热诱导取向聚集与热诱导疏水聚集的协同作用。本项目研究结果对调控食品体系内常温催化反应及脉冲电场工艺条件筛选具有实际指导意义。