新型番荔枝有效成分衍生物FLZ脑内代谢特点的研究

FLZ为番荔枝酰胺衍生物，药效学显示具明显的抗帕金森氏病（PD）作用。对其药代特性研究发现，FLZ能够通过血脑屏障（BBB）进入大鼠脑内，而且在脑内的吸收和消除与血液中的同步，但是FLZ的脑内AUC与血中比值只有5%，说明FLZ进入大鼠脑内受到了限制。深入研究影响FLZ进入脑内的机制，阐明FLZ进入脑后的代谢特点，是关系FLZ成药性的重要问题。本课题在已开展的药代研究基础上，建立更灵敏的HPLC-MS/MS方法检测FLZ含量，同时分析FLZ在正常大鼠及在6-OHDA诱发PD模型大鼠脑内的代谢特点；采用在体脑内微透析技术及原代培养脑微血管内皮细胞形成的体外BBB模型，利用特异性抑制剂，研究已明确与PD病相关的，且人和大鼠BBB均高表达的ABC超家族转运蛋白P-gp和BCRP对FLZ通过BBB影响，深入分析影响FLZ透过BBB进入脑内的因素，阐明其脑内的代谢特点及在生理和病理条件下的代谢异同。

作为治疗中枢神经系统疾病的药物，其脑内代谢特点，特别是在病理条件下的代谢特点对该药的成药性评价至关重要。本项目首先对FLZ在正常及6-羟基多巴胺诱发的帕金森氏病大鼠脑内分布进行了研究。建立了一个准确、快速、灵敏的高效液相色谱-三重四极杆质谱联用（HPLC-MS/MS）的方法，对大鼠脑组织和血浆中的FLZ浓度进行测定。能够满足大鼠脑组织和血浆中FLZ的测定要求。应用所建立的方法测定了正常大鼠，以及6-羟基多巴胺损伤黑质部位神经元，形成帕金森氏病（PD）大鼠。结果表明，FLZ静脉给予正常大鼠后，迅速透过血脑屏障，平均血脑屏障透过率为0.073（药物100%透过时，透过系数为1），且在所采集的7个区域分布无明显差异。FLZ在PD大鼠的脑组织各区域之间分布无明显差异。通过测定大鼠预先给予P-糖蛋白(P-gp)抑制剂和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）抑制剂后脑组织和血浆中FLZ浓度，结果表明，P-gp被抑制后，FLZ透过血脑屏障的程度大幅升高，而BCRP被抑制后，对FLZ透过血脑屏障无显著影响。由于FLZ的血浆蛋白结合率高于90%，因此采用微透析取样技术实时、连续地在大鼠脑组织和血中采样，研究游离FLZ在正常和PD大鼠脑内代谢特点。研究结果表明正常大鼠和PD大鼠静脉给予FLZ后，FLZ在正常组大鼠的血脑屏障透过率高于PD大鼠，但无显著性差异。成功分离并培养了正常和PD大鼠脑微血管内皮细胞（rCMECs），其中PD rCMECs的成功培养为首次，该细胞保留了在体PD大鼠脑内皮细胞损伤和紧密连接（TJs）破坏的病理学改变。利用上述原代细胞与C6细胞不同方式共培养，建立四种体外BBB模型，经过系统评价，该四种模型虽有所差异，但均稳定可靠，能较好模拟生理和PD病理BBB的在体状态，适用于药物体外BBB转运实验。利用该模型及多个研究发现，FLZ是P-gp的底物，而非BCRP的底物，P-gp介导的外排是FLZ在生理和PD病理状态下具有良好体外BBB透过性，却呈现极性转运特性的原因，也是影响FLZ跨BBB转运的主要因素。应用P-gp抑制剂可增加FLZ进入脑内的量。研究中同时发现，FLZ本身对6-OHDA损伤的BBB内皮细胞TJs有明显保护作用，该保护作用和PD条件下P-gp表达量升高可能是在TJs开放的病理状态下FLZ入脑未见增加的主要原因。