Wnt/Frizzled信号影响猪卵子成熟的作用及机理研究

Wnt factors function as secreted extracellular signal molecules, which regulate a wide range of biological processes, including development, physiology and pathobiology, etc. Currently, it has been well documented that Wnt signaling plays a key role in determining gonad differentiation. In addition, there are increasing evidence shedding a light on the effect of Wnt signal on ovarian follicle development. However, the underlying molecular mechanism(s) is still obscure. In present study, we aimed to elucidate the mechanism(s) by which Wnt/Frizzled signal affect the development of porcine oocytes in vitro. We will determine the expression and localization of Wnt receptor- - Frizzled family proteins using western blot and immunofluorescence techniques.Furthermore,the major Wnt singal pathway and the related biological consequences on porcine follicle development would be defined by real-time PCR assay, RNA interference, constitutively active protein overexpression, gene array, etc. Additionally, we would investigate whether there exists the interaction between Wnt signal and Follicle-stimulating Hormone(FSH)-induced signal pathways in porcine oocyte, thus promoting our understanding on oocyte development and maturation.

Wnt作为一种分泌型的细胞外信号转导因子，广泛参与生物体发育、生理和病理等过程的调控。目前已经有研究表明Wnt信号在雌性性腺发育过程中扮演关键角色。同时Wnt信号在卵母细胞成熟中也发挥潜在作用，但其作用机理仍然不清楚。本项目通过免疫荧光和实时定量PCR等技术研究猪卵母细胞中Wnt膜受体Frizzled蛋白家族成员的表达与定位；通过RNA干扰和基因转染等技术确定主要细胞内Wnt信号应答通路；通过基因芯片和生物信息学手段寻找Wnt信号下游靶分子表达模式并初步探索其所产生的生物学结果。同时通过分析Wnt信号与促卵泡激素介导的信号通路之间的互作关系，以期系统的阐明Wnt信号在猪卵子成熟过程中的作用及作用机制，绘制较为详细的猪卵母细胞中Wnt作用图谱，为人类认识卵母细胞成熟提供新的理论依据。

Wnt信号通路在卵巢卵泡发育成熟方面具有重要作用，但其对大型哺乳动物卵子成熟发育的作用机制还不清楚。本项目（1）研究了Wnt信号通路受体家族Frizzleds在猪卵巢中的表达与定位，筛选出高表达受体，确定了受体在卵子发生过程中的时序表达。（2）建立了高效、稳定、科学的猪卵母细胞获取方法，并构建了成熟率高达82.5%的猪卵母细胞成熟培养体系。（3）阻抑Wnt信号经典通路，成熟培养后提高了卵丘扩散，促进卵子成熟和早期胚胎发育的能力。（4）抑制Wnt经典信号通路后，表明卵母细胞成熟能力的Cdc-2、Bmp-15、Mos的mRNA的表达量显著增加，而Gdf-9的表达量显著降低。（5）抑制剂SB202190从 p38MAPK本体水平及抑制其磷酸化水平抑制p38MAPK的作用，但是Wnt通路关键基因β-catenin表达显著降低，揭示p38MAPK可能通过其他通路抑制卵子减数分裂的恢复。（6）添加0.8 ng/m L褪黑素体外培养有腔卵泡，提高了A 级COCs 比率，卵泡存活率和卵膜完整性。（7）阻抑Wnt通路显著地降低猪卵巢颗粒细胞细胞活力、上调了凋亡基因Caspace-3，TNFAIP6，并且诱导了细胞周期蛋白基因CCNA2，CCNB1下调和CCND2 的上调。（8）Wnt通路的抑制显著上调了颗粒细胞类固醇合成相关基因CYP19A1，StAR，PTSG2的表达，并上调了受体FSHR基因表达，同时下调了ESR2。而单独添加褪黑素具有相反的作用，但是同时添加抑制剂和褪黑素时，褪黑素不能逆转Wnt信号通路抑制作用，揭示褪黑素可能通过Wnt信号通路对卵巢颗粒细胞产生影响。（9）褪黑素可通过受体MT2激活途径以发挥其抗凋亡、抗氧化以及类固醇生成调控作用。（10）抑制PI3K/AKT信号通路显著降低了β-catenin蛋白含量，表明PI3K/AKT信号通路与经典Wnt信号通路间存在关联。（11）初步揭示了非经典Wnt/Frizzled/Ca2+信号通路中的关键蛋白PLC活性的变化对猪卵巢颗粒细胞生理生化指标的调控机理，确证，PLC基因对Wnt经典通路具有一定的抑制作用。总之，本项目从猪卵母细胞及卵巢颗粒细胞两方面探讨了Wnt信号通路对于猪卵子成熟的调控机制以及与其他因素如褪黑素、PI3K/AKT信号通路等的互作，为进一步深入研究猪卵泡发育及调控提供了科学理论依据和技术支撑。