忽地笑咖啡酸氧甲基转移酶LaCOMT1提高重金属汞胁迫抗性的分子机制研究

Lycoris aurea not only has good ornamental value and medicinal value, but also has potential remediation value of heavy metals in soil. Previously, we found that Lycoris aurea could enrich copper, cadmium, cobalt and so on. In addition, a caffeic acid O-methyltransferase gene (namely LaCOMT1) related to the biosynthesis of melatonin was cloned from Lycoris aurea. LaCOMT1 was significantly induced under the stress of heavy metal Hg. Compared with wild-type (WT) plants, overexpressing LaCOMT1 in Arabidopsis thaliana enhanced the tolerance to HgCl2. In order to further analyze the function and molecular mechanism of LaCOMT1, the promoter sequence of LaCOMT1 could be cloned and analyzed. Meanwhile, the expression pattern of LaCOMT1 could also be investigated. By using yeast one-hybrid technique, the transcription factors regulating the expression of LaCOMT1 would be screened and identified. Additionally, the roles of LaCOMT1 under Hg stress could be verified by overexpression and complementary LaCOMT1 gene in Arabidopsis thaliana and L. aurea by using transgenic method. Then, combined with RNA-Seq technology, the differentially expressed gene involved in signaling transduction pathways in transgenic plants under Hg stress could also be analyzed. This study will provide a new idea for the physiological study of heavy metal stress and provide a theoretical basis for the remediation of heavy metals in soil and the cultivation of resistant varieties of Lycoris.

石蒜属植物忽地笑不仅具有很好的观赏价值和药用价值，还具有潜在的土壤重金属修复价值。申请人前期从忽地笑体内克隆得到参与褪黑素生物合成的咖啡酸氧基甲基转移酶基因LaCOMT1，发现其受重金属Hg胁迫的诱导表达；拟南芥过表达LaCOMT1可以提高其对HgCl2胁迫的耐受性。为了进一步解析LaCOMT1响应Hg胁迫的作用方式和可能的调控机理，本项目拟克隆LaCOMT1启动子序列，分析其受诱导表达模式，采用酵母单杂交筛选调控其基因表达的关键转录因子；通过转基因忽地笑和拟南芥过表达和敲除LaCOMT1基因来验证LaCOMT1及其催化产物褪黑素在Hg胁迫下的功能；最后结合RNA-Seq技术，比较Hg胁迫下的转基因植株体内信号通路差异基因表达，发掘Hg胁迫相关的调控元件。本研究将为忽地笑的重金属胁迫生理研究提供新的思路；并为石蒜属植物土壤重金属修复和抗性品种培育提供一定的理论依据。

忽地笑不仅具有很好的观赏价值和药用价值，我们前期也发现忽地笑体内可以一定程度富集重金属铜、镉、钴等，因此也具有潜在的土壤重金属修复价值。而金属汞是自然界最危险的元素污染物之一，危害环境，对人类和动物造成各种疾病。在有关动物的研究发现，褪黑素通过与汞形成金属配体复合物，对大鼠汞中毒起到神经保护作用，在植物中该方面的研究还尚未有报道。我们从忽地笑体内克隆得到参与褪黑素生物合成的咖啡酸氧基甲基转移酶基因LaCOMT1，它不仅是催化木质素合成的关键酶，也具有N-乙酰转移酶活性，参与褪黑素最后一步合成，而褪黑素在调节植物生长、发育和胁迫中起重要作用。通过对忽地笑COMT1的ASMT活性进行了评估，来确认COMT1在异源物种褪黑素合成中的功能。大肠杆菌中得到的重组LaCOMT1蛋白具有很高的ASMT活性，但是该活性能明显被咖啡酸抑制，且具有剂量效应。通过拟南芥原生质体瞬时表达，表明LaCOMT1在细胞中定位于细胞质和细胞核中，另外，LaCOMT1在忽地笑不同组织广泛分布，而且能明显被20 μM的HgCl2诱导表达，在6h达到最大值，同时体内Hg也不断积累。在拟南芥中过表达LaCOMT1基因后，首先通过GFP荧光和 western blot检测COMT1的表达情况，再进行HgCl2处理，检测转基因拟南芥对汞耐受性的变化，在根长和鲜重方面进行数据分析，结果表明转基因拟南芥明显提高了对汞的耐受性，可能是由于通过提高抗氧化酶和增加抗氧化剂来清除活性氧(ROS)的积累。我们通过qPCR检测了活性氧相关酶的基因表达变化，其中FSD、CAT、APX、GR和MSD的表达量在转基因和野生型都有所提高，但转基因拟南芥明显高于野生型，该结果进一步确认LaCOMT1通过调节植物体内ROS稳态参与缓解汞毒性。这将对忽地笑作为观赏植物的抗性培育起到指导作用，同时也能为石蒜属植物重金属修复研究提供一定的理论依据。