alpha-香树酯醇的酶法异构机理及其微生物合成

Amyrin is a natural chemical compounds of the triterpene class which has pentacyclic structures. Amyrin is the cyclization product of 2,3-oxidosqualene catalyzed by amyrin synthase. Amyrin has two isomers which are designated as α-amyrin and β-amyrin. The α-amyrin is the precursor of the important pharmaceutical intermediate ursolic acid. However, the extraction of α-amyrin from plants are expensive because all the known α-amyrin synthases have low catalytic activities and produce a significant amount of β-amyrin by-products. Furthermore, there is no suitable α-amyrin synthases could be utilized to construct an efficient pathway for α-amyrin production. In this project, we will identify the key amino acids and structural domains of α-amyrin synthases for the cyclization and isomerization function through bioinformatics and mutation scanning, and analyze the mechanism of the isomerization function based on the protein structural information. Then, we will optimize the function domain of the α-amyrin synthases through rational design and direct evolution to obtain the mutated synthase which could completely convert 2,3-oxidosqualene to α-amyrin. We will take advantage of the selected mutated synthase to construct the biosynthesis module of α-amyrin de novo, and achieve the complete microbial synthesis of α-amyrin. This proposed project will clarify the mechanism of the enzymatic isomerization of amyrin, and provide novel research methods and artificial design strategies for the microbial synthesis and enzymatic isomerization of natural products which contains different functional isomers.

香树脂醇是五环三萜类化合物，由其合酶环化2,3-氧化鲨烯获得，具有α-型, β-型两种位置异构体，其中α-型是重要生物活性物质熊果酸的前体。目前，因所有已知的α-香树脂醇合酶都会产生大量β-型副产物，且催化效率低，导致由植物提取的α-香树脂醇成本高、价格贵，该酶也不适合其微生物外源合成体系的构建。针对这些问题本项目将通过生物信息学方法结合饱和突变来确定香树脂醇合酶催化环化和异构化反应的关键结构域或氨基酸序列，并根据蛋白质结构来解析同分异构体之间的异构转化机制，进而对香树脂醇合酶的相关结构域进行理性设计和定向进化，以获得能实现从2,3-氧化鲨烯到α-香树脂醇完全转化的香树脂醇合酶突变体，并以此为基础在酵母细胞中构建合成α-香树脂醇所需要的合成模块，实现α-香树脂醇的微生物全合成。项目研究将有助于阐明酶法异构转化机理，为众多具有异构特点的天然产物的酶法转化和微生物合成提供新的研究思路。

香树脂醇是一类五环三萜类化合物，广泛存在于植物中。其中α-香树脂醇和β-香树脂醇是两种同分异构体，分别是熊果酸和齐墩果酸的合成前体，本研究结合代谢工程、蛋白质工程及合成生物学技术，在酿酒酵母中构建α-香树脂醇合成模块。基于组学分析挖掘新基因，利用蛋白质工程改善酶活性，利用代谢工程对合成模块优化与调控，最终实现α-香树脂醇高效生产。主要研究结果如下：(1)对植物数据库进行生物信息学分析，在数据库中挖掘植物α-香树脂醇合酶，为了在枇杷等高产熊果酸植物中挖掘更多的关键基因，我们对枇杷叶片进行转录组学分析，并对组学结果进行拼接组装，利用 NR、NT、KEGG 和 Swissprot 等数据库对基因功能进行注释，得到若干个α-香树脂醇合酶和CYP450氧化酶候选基因，我们对候选基因分别进行表征。最终我们获得来源于枇杷和苹果的两个α-香树脂醇合酶(EjAS和MdOSC1)。(2)提高α-香树脂醇合酶的催化活性，对催化活性最高，产物专一性最好的MdOSC1进行工程改造，对关键氨基酸残基位点进行饱和突变，分别将α-香树脂醇的产量提高了5.6, 7.4和5.3 倍。(3)对酿酒酵母的甲戊二羟酸途径进行优化，提高前体2,3-氧化鲨烯供应，构建来自于白色念珠菌鲨烯单加氧酶ERG1、酿酒酵母ERG20和鲨烯合酶ERG9过表达盒，利用同源重组将过表达基因整合至酵母基因组的rDNA位点，重组菌α-香树脂醇的产量达到50mg/L。(4)优化摇瓶发酵的培养基pH值，葡萄糖浓度和半乳糖浓度，α-香树脂醇的产量提高至240 mg/L。补加6g/L的乙醇使α-香树脂醇的产量提高至315mg/L。采用发酵罐进行补料发酵，使α-香树脂醇的产量提高至1 g/L，比出发菌株的产量提高了约400倍。本研究通过半理性设计提高α-香树脂醇合酶的催化活性，利用代谢工程提高前体供应，同时增强细胞内存储产物能力，有效地提高了酿酒酵母合成α-香树脂醇的产量，为提高萜类化合物在酿酒酵母中的合成提供了借鉴。