丹酚酸B调控Nrf2/ARE通路在对乙酰氨基酚肝氧化损伤中的保护机制研究

Nrf2/ARE通路在肝脏疾病病理过程及防治中的研究已成为国际上新的研究热点之一。本研究利用野生型及Nrf2-/-小鼠对乙酰氨基酚肝氧化损伤动物模型以及HepG2和Hepa1c1c7细胞系，采用Westernblot 、RT-PCR、RNAi等分子生物学方法，观察丹酚酸B在野生型及Nrf2缺失小鼠对乙酰氨基酚肝损伤保护作用的差异；观察丹酚酸B对Nrf2正常表达及转染Nrf2 siRNA 细胞系二相酶的诱导作用及转录因子Nrf2 活性及表达的影响；观察在各种蛋白激酶抑制剂干预情况下，上述基因、蛋白表达及生物学活性的改变。主要证明丹酚酸B通过Nrf2/ARE通路对药物二相酶的诱导作用及Nrf2激活的相关信号转导机制；阐明Nrf2的诱导在丹酚酸B抗对乙酰氨基酚肝氧化损伤中的作用机制。本研究有利于丹参酚酸类化合物的开发和临床应用，也为肝保护作用研究提供治疗靶点和开发平台。

氧化应激是各种肝脏疾病病理改变的一个基本因素，抗氧化和药物代谢酶是抵抗外来物质毒性的主要防御机制。通过Keap1-Nrf2/ARE通路诱导抗氧化酶和二相酶的表达在某些氧化损伤性疾病、肿瘤等疾病的防治中发挥重要的作用，可能成为这些疾病防治的新的靶点。本研究利用对乙酰氨基酚肝氧化损伤动物模型以及HepG2等细胞模型，采用Westernblot 、RT-PCR、RNAi等分子生物学方法，观察丹酚酸B在小鼠对乙酰氨基酚肝细胞损伤的保护作用；观察丹酚酸B对Nrf2正常表达及转染Nrf2 siRNA 细胞系二相酶的诱导作用及转录因子Nrf2 活性及表达的影响；观察在各种蛋白激酶抑制剂干预情况下，上述基因、蛋白表达及生物学活性的改变。主要证明丹酚酸B通过Nrf2/ARE通路对药物二相酶的诱导作用及Nrf2激活的信号转导机制；阐明Nrf2的诱导在丹酚酸B抗对乙酰氨基酚肝氧化损伤中的作用机制。.主要研究成果：丹酚酸B在体内外对对乙酰氨基酚（APAP）引起的肝损伤具有显著的保护作用；丹酚酸B对APAP肝细胞损伤的保护作用与Nrf2激活、二相酶（GCLC、HO-1）诱导具有时间与剂量的的依赖性。通过体内外实验和RNA干扰技术，证明SalB是通过激活Nrf2，进而诱导二相酶GCLC和HO-1的表达；首次证实丹酚酸B对Keap1-Nrf2/ARE通路激活作用涉及PKC、PI3K/AKT信号通路，特异性抑制PKC及AKT磷酸化，明显减弱丹酚酸B抗肝损伤作用，揭示PKC、PI3K/AKT是丹酚酸B抗APAP肝损伤的重要调控靶点。在本课题扩展性实验中，首次发现丹酚酸B、丹酚酸A激活Nrf2，并可通过上调SIRT1表达抑制p66shc、p53的表达，、进一步调节凋亡相关因子表达，发挥其肝保护作用。.本项目从调节药物二相酶表达及分子机制方面阐明丹酚酸B抗毒、抗氧化的作用及机理, 在中药研究方面具有重要的意义。采用现代分子生物学技术研究临床常用活血化瘀中药的有效单体的药理作用机制，可以更好阐述中药治疗肝病的原理。该项目有助于丹参酚酸类化合物的进一步开发和利用，为其临床应用提供药理学实验依据。通过丹酚酸B激活Nrf2诱导二相酶表达及其信号转导通路的研究，为其他化合物的药物性肝保护作用研究提供新的治疗靶点和开发平台。通过对这些化学物质对肝脏疾病的作用及其作用位点的研究，对我国中医药现代化也具有战略性意义