基于NF-kB和STAT3通路的表观遗传调控的平贝母多糖的分离纯化和肺癌预防

On the basis of preventive effect of polysaccharide from Fritillaria ussuriensis Maxim on lung cancer, in this project, Ultrafiltration Membrane and Gel Column Chromatography will be used as separation methods. And the total polysaccharide, fractionation polysaccharide and pure polysaccharide of Fritillaria ussuriensis Maxim will be systematically separated and the first, two and three structural characteristics of polysaccharides will be determined. We will study on the mechanism of active polysaccharide to prevent lung cancer using cell model in vitro and whole animal model in vivo. Further we will investigate the effects of polysaccharides on key proteins such as STAT3, p-STAT3, IL-6, IL-1 beta, TNF- alpha and mRNA in STAT3 and NF- kappa B pathway. We will study Innovatively on the regulation of DNA methylation and histone acetylation in mice lung cancer cells and A549 cells by epigenetic technique. We will elucidate the efficacy and mechanism of Fritillaria in the prevention of lung cancer through the research of the correlation between microcosmic (DNA-mRNA-Protein) and macroscopical (polysaccharide- pharmacological activity - mechanism). This project expands the understanding of the traditional efficacy connotation of genuine medicinal herb Fritillaria ussuriensis, and provides a basis for developing effective new drugs that have independent intellectual property rights to prevent cancer.

在已确定平贝母多糖对于小鼠肺腺癌具有预防作用的基础上，本项目以超滤膜和凝胶柱色谱作为分离手段，对平贝母总多糖、分级多糖和均多糖进行系统地分离纯化；运用现代光谱分析方法确定多糖的一级、二级和三级结构特征；以体外细胞模型和整体动物模型为载体，对活性多糖进行预防肺癌的机制研究，探讨多糖对STAT3和NF-κB通路的中的关键蛋白STAT3、p-STAT3、IL-6、IL-1β、TNF-α等关键蛋白和mRNA的影响。创新性地采用表观遗传学技术研究平贝母多糖对小鼠肺癌细胞和A549细胞中DNA甲基化及组蛋白乙酰化的调控。通过微观(DNA-mRNA-Protein)与宏观（多糖-药理活性-作用机制）相关性展开深入的研究，从总多糖/分级多糖/均多糖三个水平来阐明平贝母预防肺癌的药效物质及作用机制。本项目拓展了对道地药材平贝母的传统功效内涵的认识，为研制效果确切、具有自主知识产权的预防癌症的新药提供依据。

平贝母是百合科（Liliaceae）贝母属植物平贝母（Fritillaria ussuriensis Maxim.）味苦、甘，性微寒，归肺、心经。具有清热润肺，化痰止咳的功效。可以用于肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，咳痰带血等症。收载于《中国药典》（2020版）一部。.本项目以不同水平的多糖为研究对象，使用人肺腺癌细胞 (A549)，建立碱性磷酸酶（SEAP）报告基因检测方法，筛选活性多糖。进行平贝母预防肺癌作用的有效部位，有效组分和活性化学成分进行筛选，通过阴-阳离子交换树脂和DEAE-52纤维素柱分离对平贝母多糖进行了良好的分离，采用丙烯葡聚糖凝胶进一步纯化，同时使用谱学手段对平贝母多糖的结构进行鉴定。从平贝母多糖中分离得到10种均一多糖，均为首次从平贝母中获得的均一多糖。以平贝母多糖成分为研究对象，建立了HPLC-DAD和GC-MS的平贝母药材的质量控制方法，为平贝母的质量控制提供了新的分析方法，为平贝母的安全合理用药，提供了理论依据。采用碱性磷酸酶（SEAP）报告基因检测方法对平贝母多糖不同组分进行了活性筛选，进而利用A549细胞模型和动物模型，研究有效组分和有效成分对STAT3/NF-KB通路中STAT3、P-STAT3、P65、P50、iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6、IL-1β等关键蛋白和mRNA水平的影响。结合表观遗传调控策略，通过对DNA甲基化和组蛋白乙酰化调控，研究了平贝母多糖对肺癌产生早期炎症分子的影响。本项目确定了平贝母药材中预防肺癌的有效组分和有效均一多糖，对平贝母均一多糖进行结构解析，确定了均一多糖的结构，确定了平贝母多糖为预防肺癌的药效物质。本项目的研究结果在国内外期刊上发表相关文章3篇，培养硕士研究生2人。本项目可深化对平贝母传统功效科学内涵的认识，为研制出疗效好、具有自主知识产权新药提供重要的科学依据。