荞麦Potato I 型蛋白酶抑制剂诱导Hep G2细胞线粒体自噬的分子机制

Potato I type protease inhibitor is a widespread inducible inhibitors, and play an important role in plant resistance to various external stimuli including wounding, insect feeding and microbial infections.Protease inhibitors as anticancer drugs have been an international research hotpot.Our group has obtained Potato I inhibitor (rBTI),which is stable,high inhibition efficiency of tumor.Experiment data indicates that rBTI could induce Hep G2 cells autophagy and inhibit tumor cell proliferation, but the molecular mechanisms is unclear. In addition, a lot of reactive oxygen species (ROS) generated in Hep G2 cells after treating with rBTI. Based on these findings, we speculate that mitochondrial dysfunction is involved in regulating ROS generation, mitophagy and ATP production. In this project, we are going to multilevelly investigate the relationship between mitochondrial dysfunction, ROS generation and mitophagy by using different means, including western blot, flow cytometry, transmission electron microscopy, and so on. Futher, we will identify the molecular mechanisms of mitophagy induced by BTI. At the same time, we will explore the effect of mitophagy induced by BTI on the cells energy metabolism by some methods of biochemistry, physilogy and molecular biology. This project will provide the theoretical basis for the safe and effective utility for the clinical application of BTI, has important theoretical significances and application value. The research of molecular mechanisms of mitophagy induced by potato I type inhibitor has not yet been investigated at home and abroad.

Potato I型蛋白酶抑制剂是植物中广泛存在的一类诱导型抑制剂，在植物抵抗病虫害及应对干旱，水涝，盐胁迫等极端条件中发挥重要的作用。近几年，蛋白酶抑制剂作为抗肿瘤药物也受到国内外研究者的特别关注。我们前期的研究获得一种分子量小，活性稳定的荞麦Potato I 型抑制剂（rBTI）。功能分析揭示rBTI可作用于不同肿瘤细胞，能通过诱导肿瘤细胞自噬抑制肿瘤细胞增殖，但其诱导肿瘤细胞自噬的分子机制仍不清楚。该项目采用Western blot, 流式细胞术，透射电子显微镜等手段，研究rBTI 对Hep G2 细胞线粒体的损伤，诱导细胞内ROS升高，导致细胞自噬的分子机制，检测rBTI诱导Hep G2细胞线粒体受损后ATP生成量的变化。通过本项研究初步阐明rBTI诱导Hep G2细胞自噬的分子机制以及对肿瘤细胞能量代谢的影响，为蛋白酶抑制剂基因工程抗肿瘤药物的深入研究及临床应用研究奠定基础。

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂rBTI可以抑制细胞增殖，但是rBTI诱导肿瘤细胞发生自噬的机制还不清楚。rBTI作用于肝癌细胞Hep G2后，线粒体数量明显减少，且伴随有大量自噬泡的产生，推测rBTI诱导Hep G2发生的自噬为线粒体自噬。因此本项目围绕rBTI诱导Hep G2细胞线粒体自噬的分子机制这一科学问题展开研究，主要取得以下结果：. （1）rBTI作用于Hep G2, 分别用激光共聚焦显微镜、流式细胞术等多种技术手段观察和测定了rBTI诱导线粒体自噬的指标。结果显示，rBTI作用于Hep G2细胞后，线粒体膜电位降低，活性氧显著升高；细胞自噬相关分子表达量升高，线粒体标志分子Tom20表达水平降低；同时，实验还发现rBTI诱导产生的ROS可以作为一种信号分子，诱导线粒体自噬的发生。表明rBTI作用于Hep G2细胞后，引起线粒体膜电位降低，活性氧的大量产生，进而诱导线粒体自噬的发生。. （2）研究了rBTI如何通过调控PI3K/Akt负调控蛋白PTEN调节细胞的增殖及周期阻滞。结果表明，rBTI能显著抑制Hep G2细胞增殖，将细胞周期阻滞在G0/G1 期，并呈时间和剂量依赖性；rBTI作用于Hep G2后，可显著上调PTEN和p-PTEN的表达，同时发现过表达的p-PTEN分布于细胞核中，能与核仁共定位；rBTI作用细胞后，PTEN基因表达和ROS生成增加，而且表现出一定相关性；rBTI能促使细胞中PTEN和p-PTEN表达上调；细胞内ROS水平有所下调，同时细胞内PTEN和p-PTEN的表达也随之下调。因此，细胞内PTEN表达升高由rBTI诱发的ROS升高所介导。. （3）对rBTI诱导Hep G2细胞线粒体自噬的分子机制进行了详细研究。当rBTI作用于已转染pEGFP-LC3质粒的Hep G2细胞后，细胞中EGFP-LC3蛋白表达上调，并且LC3的聚集状态发生明显变化，胞质中的LC3以点状形式存在；Western blot结果表明，rBTI作用于Hep G2细胞后，细胞内LC3 II/I比值升高、自噬底物p62表达降低，同时发现PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白p-AKT和p-mTOR表达降低。因此，我们得出上调PTEN的表达，抑制PI3K/AKT通路，从而诱导Hep G2细胞发生自噬是rBTI诱导自噬的分子机制，线粒体的损伤是自噬发生的前提。