活性黄嘌呤氧化酶的体内源头辅助装配研究

Xanthine oxidase (EC 1.17.3.2, XOD) is an important oxidoreductase applied in diagnosing clinical diseases, synthesizing nucleoside drugs and degrading environmental organic pollutants. To date, the commercial XODs are available by extracting from bovine milk and wild-type microbes, but all the existing methods are still suffering from low efficient assembly of active XOD, which causes a mixture of active XOD, inactive XOD and their precursor protein xanthine dehydrogenase (EC 1.17.1.4, XDH). To solve this key problem, the present project provides an in vivo and ab initio-aided assembly strategy by strengthening the assembly of redox center and transformation to active XOD. The new strategy includes: 1) introducing chaperone protein XdhC and sulfurase enzyme NifS to aid the molybdopterin sulfuration and its insertion into the molybdenum cofactor to form the precursor active XDH; 2) incorporating the protein disulfide isomerase DsbA and its activating enzyme DsbB to help active XDH to form disulfide bond, which results in the transformation of XDH to reversible XOD；3) separately expressing the three XOD protein fragments corresponding to the natural proteolysis of XOD to assist the irreversible transformation of XDH to XOD. The in vivo and ab initio-aided assembly of XOD strategy would probably be advantageous to the existing methods by extracting XDH from bovine milk or microbe cells and in vitro transforming from XDH to XOD as it not only dispenses the uncontrollable proteolysis process but also irreversibly forms active XOD. The study will also implement this new strategy to efficiently overexpress pure active Arthrobacter luteus XOD in Escherichia coli, which would lay foundation for novel alternative genetic engineering route for commercial XOD production.

黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)是一种在临床诊断、核苷类药物合成和有机污染物降解等领域具有重要应用的氧化还原酶类，但是目前生产方法仍然存在着装配效率低下、活性态XOD与非活性态及其前体蛋白混杂的问题需要解决。本项目拟采用体内源头辅助装配的思路，通过强化XOD氧化还原中心组装和向活性态转变过程，重点解决高效装配高活性XOD这一关键问题。分别从辅助活性态硫化钼蝶呤辅基的形成及其组装为活性前体蛋白、辅助二硫键形成促使前体蛋白向活性XOD的可逆转变和体内分段合成酶蛋白促使不可逆转变三个方面进行研究，以期构建在大肠杆菌体内高效表达高活性藤黄节杆菌XOD的细胞工厂。本项目的实施，可望建立高效生产高活性XOD的调控策略，并为实现基因工程法生产商品化XOD打下基础。因此，具有重要的科学意义和应用价值。

黄嘌呤脱氢酶（XDH）及其翻译后修饰形成的黄嘌呤氧化酶（XOD），分别以NAD和O2为电子受体，催化氧化嘌呤、含氮杂环分子和醛类等多种物质，因此可被用于基础医学研究、临床诊断、核苷类药物和有机污染物降解等领域。然而，作为一种包含[2Fe-2S]簇、FAD和硫化钼蝶呤三种辅因子的复杂氧化还原酶类，目前XDH/XOD的生产仍然存在酶活低、装配效率低、活性态XOD与非活性态及其前体蛋白混杂的问题需要解决。本项目从以下三个方面开展研究：1）基因探矿方法挖掘新型高活性XDH基因；2）基于体内源头辅助装配的思路，通过强化XDH氧化还原中心组装和向活性态转变过程、构建高效装配高活性XDH的大肠杆菌细胞工厂；3）基于电子受体区域改造构建适于一步法生产的新型XOD。首先，挖掘获取的新型碱性Acinetobacter baumannii XDH，对黄嘌呤的Km和kcat值分别为25.3 μM和69.3 s-1，对应的催化效率（kcat/Km）为2.74 μM-1s-1，优于已报道天然XDH。以野生型Rhodobacter capsulatus XDH（RcXDH）为实验材料，以基因簇形式在体内独立表达其[2Fe-2S]簇和FAD结构域编码区域，获取了新型(αβγ)2型XDH，耐温性提高11℃，转化数和催化效率分别提高1.15倍和1.66倍，达200.08±4.29 s-1和3.64 s-1μM-1，是迄今为止报道最高值。其次，辅助蛋白NifS、IscS和DsbB的过表达将RcXDH粗酶液的比酶活提高30%、94%和49%；组合表达NarJ和IscS的细胞工厂将单位菌体酶活提高1.29倍，菌体量提高1.14倍，总酶活提高3.9倍。粗酶液具有与纯化酶液几乎相同的电子传递和产物生成的偶联效率，表明氧化还原中心的完整性和组装的高效性，为建立新型高效生产高活性XDH的方法奠定了基础。最后，通过重构RcXDH电子受体区域中FAD结合部位及结合NAD的Loop区，获取了三个突变体，S362A、 F270L和D358 insert，氧化酶活性分别提高122倍、63倍和2125倍。同时，选取耐辐射球菌尿酸酶转录调控蛋白，构建了将尿酸浓度信号转化为绿色荧光信号的尿酸生物传感器，基于转录蛋白（OxyR）优化建立了大肠杆菌体内检测H2O2的全细胞生物传感器，为XOD/XDH的定向进化提供了工具。