植物乳杆菌DMDL9010中亚硝酸盐还原酶与电子供体蛋白协同降解亚硝酸盐的机理研究

Nitrites are potential carcinogens and can cause acute poisoning and chronic hazards, which poses a potential food safety issue. Our previous study showed that Lactobacillus plantrum DMDL9010 which was screened from Chinese Paocai can efficiently degrade the nitrite and the nitrite reductase (NIR) is the key enzyme during the nitrite degradation. NIR has the nitrite degradation activity only in the presence of electron donor protein. And the nitrite degradation process involves both electron transfer and reduction in the active center of NIR. In this study, these two critical processes of NIR from Lactobacillus plantrum DMDL9010 are poorly understood and will be investigated. Firstly, the metabolic process of nitrite reduction in cell will be examined by means of proteomics technology to discover the reduction mechanism involved the comlex of NIR and electron donor protein. Using the protease film voltammetry and X-ray crystallography technology, the Recombinant protein NIR was proposed by prokaryotic cells expression and used for the two key processes, such as electron transfer and reduction of nitrite reduction. The key amino acids in active center of NIR are conducted for site-specific mutagenesis to further reveal the above important mechanisms to explain the relationship of structure-activity. Our project results will discover the stucture associated nitrite degradation by NiR and NiR-parter protein (electron donor protein) instant complexes. These discoveries will not only enrich denitrification theory and act as a supplement, but also will provide the theoretical basis for the food industry and its upstream industry in order to degrade nitrites.

亚硝酸盐是一种潜在的致癌物，可造成急性中毒和慢性危害，会引发潜在的食品安全问题。前期从泡菜中筛选到具有很好降解亚硝酸盐作用的植物乳杆菌DMDL9010，并且发现其中亚硝酸盐还原酶是降解亚硝酸盐的第一限速酶，这个酶仅在电子供体蛋白参与下才能降解亚硝酸盐，而降解过程涉及到电子在活性中心的电子传递和还原的两个关键过程。针对植物乳杆菌DMDL9010中亚硝酸盐还原酶与电子供体蛋白复合物为研究对象，拟在此乳酸菌细胞内，利用蛋白质组学技术研究细胞内亚硝酸盐还原的代谢过程；拟通过原核细胞大量表达NIR，利用蛋白酶膜伏安法和X-衍射法表征NIR进行电子传递和还原的两个关键过程，同时还对NIR的活性中心关键氨基酸，进行定点突变，以进一步揭示NIR-电子供体蛋白的复合物构效与亚硝酸盐降解的内在关联。为丰富反硝化理论提供补充，也为食品工业及其上游产业中亚硝酸盐降解提供理论依据。

从基因型和表型对LP9010的安全性和益生性进行研究。全基因组测序发现LP9010含有一个长为3,334,776 bp的环状染色体，平均G+C含量为44.47%，共有3324个编码基因； LP9010中具有亚硝酸盐还原酶基因pgl，说明该菌具有降解NO2-的能力；.利用转录组学和蛋白质组学技术对LP9010降解亚硝酸盐途径进行研究。结果表明菌株LP9010 能在24小时将276 mg/L的亚硝酸盐降解完。该菌在亚硝酸盐胁迫下细胞内mRNA量发生变化，这些基因调控细胞内糖代谢，脂质代谢，氨基酸代谢，辅助因子和维生素代谢等活动产生大量NADH和FADH2，其提供的电子通过电子传递链传递给亚硝酸盐还原酶（NiR），将亚硝酸盐降解成氨，氨被谷氨酰胺合成酶催化生成谷氨酰胺。.利用RNA-Seq测序、分子对接技术研究了在NO2-胁迫下的应答机制。结果表明LP9010对NO2-有一定的耐受性，其菌体形态受NO2-浓度的影响。RNA-Seq测序发现LP9010的应答机制可能包括：在NO2-胁迫下， LP9010细胞形态会延长，DNA复制加快和产生更多的能量物质（NAD+和ATP），从而修复细胞膜损伤，还调节细胞内金属离子和硫氧还蛋白系统平衡而加速解毒，另外适当浓度NO2-可促进NiR降解NO2-。NO2-可与亚硝酸盐降解关键酶Cd1NiR（pgl）上的活性位点PRO87和PRO88残基形成两个氢键进行相互作用。.总之，（1）通过下调嘧啶生物合成的基因簇的表达水平，上调参与DNA复制和组装的相关基因表达水平，使得DNA复制加快，促进LP9010细胞增长。（2）暴露于亚硝酸钠环境下的LP9010通过调节糖酵解、三羧酸循环、乙醇厌氧发酵途径等代谢和能量物质产生，从而导致NAD+和ATP的产生。（3）亚硝酸钠可促进LP9010的碳水化合物、蛋白质和脂肪酸的合成，进而助于细胞膜磷脂的生成提供能量和物质供应，从而修复亚硝酸钠胁迫造成的细胞膜损伤。（4）调节金属离子和氧化还原内平衡状态，防止Fenton反应的发生，提高细胞内过氧化物酶类和蛋白质修复酶类的活性，从而降低亚硝酸钠对细胞的伤害和加速过氧化物的解毒和损伤蛋白的修复。（5）适当浓度的亚硝酸盐可以促进LP9010产生亚硝酸还原酶来降低亚硝酸钠的含量。这些理论为丰富反硝化理论提供补充，也为食品工业及其上游产业中亚硝酸盐降解提供理论依据。