从VEGFR-3负反馈抑制TLR4-NF-κB信号通路的作用探讨异功散对慢性病贫血脾脏巨噬细胞铁代谢的调节机制

Our previous study has shown that, after stimulation with LPS, the expression of toll-like receptor 4 (TLR 4) on the surface of macrophage was decreased by YGS, accompanied by the reduction of hepcidin. Based on the new theory, TLR4-NF-κB signaling pathway restrained by VEGFR-3 negative feedback, we propose the hypothesis that YGS could treat anemia of chronic disease (ACD) by inhibiting TLR4-NF-κB signaling pathway via VEGFR-3 negative feedback. In this study, two animal models (ZIGI mice, FCA induced adjuvant arthritis rodent model), and two cell culture models (LPS treated RAW264.7 and VEFGR-3 siRNA knockdown RAW264.7) are set up, while VEGFR-3 agonist and antagonist are used as control groups. We try to validate whether YGS could influence VEGFR-3 and its downstream signaling pathway, including TLR4-NF-κB、PI3K-Akt1、SOCS1 and iron metabolism of macrophage, by in vivo and in-vitro study and from negative and positive aspects. We hope our study will unveil the mechanism(s) of YGS treating ACD.

课题组前期工作发现，脂多糖(LPS)刺激下，异功散(YGS)体外使巨噬细胞表面Toll样受体4(TLR4)进一步减少，且伴随铁调素(hepcidin)下降。结合“VEGFR-3负反馈抑制TLR4-NF-κB信号通路”的新认识，提出“YGS通过VEGFR-3负反馈途径抑制TLR4-NF-κB信号通路而治疗慢性病贫血(ACD)”的假说。拟采用两种动物模型（ZIGI小鼠、佛氏佐剂诱导的关节炎大鼠模型），以及两种细胞模型（LPS刺激RAW264.7细胞株、siRNA技术沉默RAW264.7细胞株VEGFR-3基因），并设VEGFR-3激动剂和拮抗剂对照，围绕VEGFR-3下游TLR4-NF-κB、PI3K-Akt1、SOCS1信号通路以及巨噬细胞铁代谢的关键环节，从整体动物与体外细胞两层次、正反两方面验证YGS是否可以作用于VEGFR-3而引发下游相关信号通路，以阐释该药治疗ACD的主要作用机理。

1.项目背景：过度或持续性的TLR4活化会引起过激炎症反应，造成靶器官的损伤。TLR4处于持续活化状态会引发免疫反应过激，导致铁代谢紊乱，导致慢性病贫血（ACD）。因此，在基础疾病无法逆转时，通过调节TLR4通路中的调控分子，抑制TLR4的过度活化，解决ACD免疫反应过激问题，可能是探寻ACD治疗的新思路。.2.主要研究内容：采用两种动物模型（ZIGI小鼠、佛氏佐剂诱导的关节炎大鼠模型），以及两种细胞（RAW细胞和脾原代细胞），并设VEGFR-3激动剂（LPS）和拮抗剂对照（抑制剂Sesamin和si-RNA），围绕VEGFR-3下游TLR4-NF-κB、SOCS1信号通路以及巨噬细胞铁代谢的关键环节，从整体动物与体外细胞两层次、正反方面验证YGS是否可以作用于VEGFR-3而引发下游相关信号通路。3.重要结果、关键数据：体内实验发现：异功散具有促进红细胞生成、改善铁代谢、抑制炎症的作用。特别是对ZIGI模型小鼠的上述作用更显著，优于阳性对照药物EPO；异功散可下调VEGFR-3配体VEGF-C蛋白或基因，上调SOCS1基因，降低TLR4、NF-kB蛋白及MD-2、CD14；异功散对模型小鼠脾M1型巨噬细胞（F4/80+CD80+）总数无影响，但可减少M1型巨噬细胞的活化（F4/80+INF-γ+）。体外实验提示：当VEGFR-3基因表达下降时，异功散主要通过上调VEGFR-3配体VEGF-C蛋白，或激活SOCS1、PI3K-Akt1通路，抑制TLR4，降低pp38蛋白，下调HAMP基因，增加Fpn蛋白，促进铁代谢；当VEGFR-3沉默后，LPS无法诱导VEGFR-3基因表达，同时给予异功散时，VEGFR-3基因表达升高，LPS对HAMP 基因的诱导作用减弱，HAMP表达下降。.4.科学意义：初步阐明异功散Hepcidin-Ferroprtin轴的调节作用还可以通过VEGFR-3负反馈抑制TLR4-NF-κB信号通路来实现，对异功散改善ACD铁代谢的作用机制进行了补充。