GPR56调控脑白质轴突髓鞘化的分子机制研究

The promotion of endogenous axon remyelination is an attractive strategy for treatment of multiple sclerosis (MS). The differentiation and maturation of oligodendrocyte precursors (OPCs) are essential for myelination. Studies have shown that Id2/Id4 inhibits the differentiation and maturation of OPCs through interaction with Olig1/Olig2. Our previous data have shown that Gpr56 is involved in axonal myelination in the corpus callosum; however, its mechanism remains obscure. PLP:GFP/Gpr56-/- mice showed that the absence of GPR56 markedly reduced the number of mature oligodendocytes. Therefore, we hypothesize that Gpr56 knockout might upregulate expression of Id2/4 and its translocation into the nucleus. The translocation of Id2/4 inhibits the maturation of OPCs through interaction with Olig1/Olig2 and results in hypomyelination. This study attempts to elucidate the molecular mechanisms by which Gpr56 might modulate the axonal myelination using confocal microscopy, co-immunoprecipitation, in situ hybridization etc. It is envisaged that Gpr56 may serve as a potential therapeutic target for remyelination in MS.

促使内源性轴突再髓鞘化是治疗多发性硬化(MS)的重要策略。少突胶质前体细胞（OPCs）分化成熟是轴突髓鞘化的必要条件，研究表明Id2/Id4与转录因子Olig1/Olig2相互作用可以抑制OPCs分化成熟。我们前期研究发现Gpr56参与了脑白质轴突髓鞘化，然而其机制不明。进一步转基因动物实验显示：Gpr56基因敲除致胼胝体中成熟的GFP: PLP+ OLs数目明显减少，表明Gpr56促进了OPCs分化成熟。由此，我们推测Gpr56基因敲除后诱导Id2/Id4高表达并向核内移位，与Olig1/Olig2结合而抑制OPCs分化成熟是导致轴突低髓鞘化的重要原因。本项目拟采用激光共聚焦、免疫共沉淀、原位杂交等方法，以阐明Gpr56基因调控轴突髓鞘化的分子机制，为确立GPR56作为促进MS轴突再髓鞘化治疗新靶点提供充分的科学依据。

少突胶质前体细胞（OPCs）分化成熟和神经元轴突正常发育是轴突髓鞘化的必要条件，Gpr56参与了脑白质轴突髓鞘化，然而其机制不明。本课题研究的目的是探讨Gpr56影响轴突髓鞘化的分子机制。筛选出Gpr56基因杂合型(Gpr56+/-)和敲除型(Gpr56-/-)小鼠，随机分为2组：Gpr56+/-和Gpr56-/-组。每组根据小鼠出生后时间分为出生后7天、14天、21天、28天(P7d、P14d、P21d、P28d)四个亚组。应用FluoroMyelin染色观察出生后P7d、P14d、P21d、P28d Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠脑胼胝体内髓鞘形成。应用免疫组化染色和Western Blot方法监测髓鞘碱性蛋白(MBP)和2、3-环核苷酸3-磷酸二酯酶 (CNPase)、髓鞘蛋白脂质蛋白(PLP)、神经纤维丝蛋白(NF-200)在P7d、P14d、P21d、P28d GPR56+/-和GPR56-/-小鼠脑胼胝体白质中的表达；用荧光免疫组化染色观察P7d GPR56+/-和GPR56-/-小鼠胼胝体内PDGF-aR阳性（PDGF-aR+）即少突胶质前体细胞(OPCs)的数量。用原位杂交检测P28d GPR56+/-和GPR56-/-小鼠胼胝体内髓鞘蛋白脂质蛋白(PLP)阳性(PLP+)细胞数。用电镜观察P28d小鼠胼胝体白质内轴突髓鞘化，比较轴突髓鞘的厚度和轴突直径的大小。用P1d Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠皮质做体外神经元培养，观察两组神经元轴突的长短；用P1d Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠皮质做体外OPCs培养并诱导其分化成熟，观察pro-oligodendroblast、immature oligodendrocyte和mature oligodendrocyte阶段O4+细胞百分比。与Gpr56+/-小鼠比较，MBP、CNPase、PLP和NF-200蛋白在P14d、P21d、P28d Gpr56-/-小鼠脑胼胝体白质中的表达明显下降，胼胝体中髓鞘的形成明显减少。荧光免疫组化和原位杂交结果显示P7d GPR56+/-和GPR56-/-小鼠胼胝体内PDGF -aR+ 细胞数量无差异，但P28d GPR56+/-小鼠胼胝体内PLP+细胞数明显多于P28d GPR56-/-小鼠。电镜见P28d Gpr56-/-小鼠脑胼胝体白质内