携带双自杀基因的可回复永生化肝细胞株优化及应用

生物人工肝是肝脏功能替代治疗的一种重要技术方法，细胞的稳定来源及安全性是急需解决的关键问题。已知SV40T能促进原代肝细胞体外永生化增殖，可获得足够数量的细胞，但其长期存在于细胞并导入体内可能导致恶性转化。近年来，围绕如何降低SV40T永生化肝细胞应用于人体的危险性开展了大量研究。鉴于现有可回复永生化方法的缺陷，我们优化设计了一种携带双自杀基因（胞嘧啶脱氨酶CD及单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-tk）的可诱导敲除系统，创造性地将Cre-LoxP 位点重组技术用于双自杀基因的可控性表达，通过逆转录病毒系统一次性导入SV40T、CD及HSV-tk基因，构建一种新型的可回复永生化肝细胞株。该细胞株既能在体外不断增殖又能保证肝细胞的表型和正常功能，在体内应用前将可疑致癌和抑制肝细胞功能的永生化基因敲除，并且进入体内的外源细胞也能在药物作用下自杀，有望为生物人工肝技术提供一种稳定、安全的理想肝细胞来源。

中文摘要(对项目的完成情况及取得成果做简单概述，1000字以内)：.本项目将Cre-LoxP定点敲除系统运用于双自杀基因的可控性表达，获得一种可回复永生化人肝细胞株，保证获得足够来源的细胞，并具有良好的生物安全性，解决目前生物人工肝技术中细胞来源缺乏及体内应用的安全性问题。具体研究结果如下：1. 比较了成体肝细胞与胚胎肝干细胞的体外分离培养及增殖和成熟分化的生物学特性：胚胎来源的HP14.5d肝祖细胞较成体肝细胞LC3m增殖能力强，能够高表达肝干细胞的标志，低表达或不表达特异性的成熟肝细胞标志，属于低分化阶段的肝实质细胞， 2%HS+0.1μmol/L Dex+10ng/mlHGF+20ng/mlFGF4诱导后可向成熟肝细胞分化，ICG摄取和糖原合成功能显著增强，更适用于肝细胞移植的种子细胞。2. 采用两步法成功构建了携带双自杀基因的可回复永生化肝细胞株，该细胞株能分别表达SV40T永生化基因和CD、HSV-tk双自杀基因，并在Cre-Loxp位点特异性重组下实现HSV-tk的可控性表达，细胞在裸鼠皮下不成瘤，生物安全性好，并在5-FC前体药物的作用下选择性自杀。3. 建立了不同CCL4浓度诱导的急性肝衰竭小鼠模型，其中2%CCl4的诱导模型肝脏损伤适度，自身修复能力有限，可反应肝细胞移植治疗的效果。肝细胞移植可提高模型小鼠存活率，恢复肝脏指数，显著改善AST和ALT水平，逆转肝脏的病理改变，对肝损伤具有较强的修复作用。