RIP1/RIP3通路调控脑出血后细胞程序性坏死的机制研究

The mechanism of necrotic cell death after intracerebral hemorroage (ICH) is not full understood yet. Recent studies found that some kind of necrotic cell death, named programmed necrosis or necroptosis, is regulated by receptor interacting protein kinase 1 (RIP1) and RIP3, and can be inhibited by a small molecular weight chemical necrostatin-1 (Nec-1). However, it’s still unknown whether RIP1/RIP3 pathway has their role in necrosis after ICH. The present study will investigate the role of RIP1/RIP3 pathway on the necrotic cell death after ICH through using specific inhibitor or gene inhibition technique in in vivo and in vitro ICH models. And we will further explore the possible neuroprotective mechanisms of Nec-1 in mice after ICH. Through this study, we hope to further clarify the molecular mechanism of necroptosis in ICH, which will provide foundation and data for future studies and may lead to new targets and directions for therapy and study in ICH.

脑出血（Intracerebral hemorroage, ICH）后的细胞坏死调控机制目前尚未完全清楚。新近的研究发现一些细胞坏死可通过受体相互作用蛋白激酶1（RIP1）和RIP3两个关键蛋白激酶调控，并可被小分子抑制剂Necrostatin-1（Nec-1）抑制，这种细胞坏死被称作程序性坏死或Necroptosis。但目前尚不明确该机制是否也在脑出血细胞坏死中发挥作用。本课题拟通过体内、体外研究，运用抑制剂及基因干扰技术，深入探讨RIP1/RIP3通路在调控小鼠脑出血后细胞坏死中的作用机制，并剖析Nec-1在小鼠ICH中的神经保护作用机制。通过本课题的研究，以期阐明ICH后细胞程序性坏死调控的分子机制，为后续研究提供基础和实验依据，有望为脑出血研究和治疗提供新的靶点和方向。

目的：脑出血（Intracerebral hemorrhage, ICH）后的细胞坏死调控机制目前尚未完全清楚。新近的研究发现一些细胞坏死可通过受体相互作用蛋白激酶1（Receptor-interacting protein 1, RIP1）和RIP3两个关键蛋白激酶调控，并可被小分子抑制剂Necrostatin-1（Nec-1）抑制，这种细胞坏死被称作程序性坏死或Necroptosis。但目前尚不明确该机制是否也在脑出血细胞坏死中发挥作用。本课题拟深入探讨RIP1/RIP3通路在调控小鼠脑出血后细胞坏死中的作用机制，并剖析Nec-1在小鼠脑出血中的神经保护作用机制。通过本课题的研究，以期阐明ICH后细胞程序性坏死调控的分子机制，为后续研究提供基础和实验依据，有望为脑出血研究和治疗提供新的靶点和方法。 方法：采用IV型胶原酶诱导建立小鼠脑出血模型，应用Western blot和免疫荧光检测RIP1、RIP3和MLKL在血肿周围脑组织中的表达水平，同时使用碘化丙啶染色和电镜明确细胞死亡类型，获得脑出血后脑组织发生程序性坏死的可靠证据；将动物随机分为Sham组、ICH+DMSO组和ICH+Nec-1组。在脑出血前15分钟经侧脑室注射单一剂量的Nec-1或者DMSO，通过评估各组动物的出血程度、神经功能状态、脑水肿、血脑屏障破坏、神经炎症等来评价Nec-1的神经保护作用。 结果:脑出血后7天内，血肿周围组织程序性坏死相关蛋白RIP1、RIP3和MLKL蛋白表达水平明显增加，在脑出血后第3天达到高峰。免疫荧光染色显示这些蛋白主要表达于神经元细胞浆；经侧脑室注射Nec-1可以显著改善脑出血后的血脑屏障破坏、减轻脑水肿、减少坏死性细胞死亡，促进神经功能恢复；Nec-1显著抑制程序性坏死相关蛋白RIP1、RIP3和MLKL的表达、减少炎症介质释放，但对细胞凋亡活性没有显著影响。 结论: 在脑出血早期，血肿周围脑组织存在RIP1/RIP3通路依赖的细胞程序性坏死激活，坏死细胞主要是神经元，提示程序性坏死可能参与调控脑出血后细胞死亡。Nec-1治疗可以明显减轻小鼠脑出血后的脑水肿、改善血脑屏障通透性，减少细胞坏死，促进神经功能恢复。这些结果表明，Nec-1可以减轻脑出血后脑损伤程度。此外，Nec-1的神经保护作用是在不影响细胞凋亡活性的前提下，通过抑制RIP1激酶活性进而阻断程序性坏