基因－MicroRNA共表达肿瘤腺病毒治疗新方法的研究

本项目以共表达策略的思路为出发点，将模拟microRNA前体结构的siRNA置于基因3'非翻译区表达，构建由人端粒酶逆转录酶启动子（hTRTP）介导的基因和siBcl-2共表达的腺病毒表达载体，以达到由一个启动子同时表达目的编码基因和小干扰RNA的目的。研究表明Bcl-2高表达可抑制trail蛋白对肿瘤细胞的凋亡诱导作用，而降低Bcl-2的表达可明显增强肿瘤细胞对trail蛋白的敏感性，因此TRAIL与siBcl2的搭配将可能对肿瘤细胞产生正反两方面协同杀伤作用。而hTRTP则赋予了病毒载体的肿瘤特异性，从而可以更大程度上避免病毒载体对正常细胞的误杀。共表达策略使用同一载体带有目的基因和基因3'非翻译区可产生对抗过表达基因的siRNA，可有效地避免多载体转染时的竞争性抑制。该方法的研究能给肿瘤基因治疗提供新思路，并为共表达策略在肿瘤基因治疗领域的应用奠定基础。

恶性肿瘤的发生、发展涉及多种基因的异常，要从本质上治疗恶性肿瘤，基因治疗是最具有潜能的新措施,本课题首先以高效的腺病毒作为载体，对肿瘤基因治疗进行探索。研究发现H101联合Bcl2 的小干扰RNA（siRNA）对肿瘤细胞的毒性效果以及凋亡诱导率都明显优于单独治疗，并首次发现 H101 对视网膜母细胞瘤（RB）的体内外生长均有明显的抑制作用。我们通过hTRTP具有肿瘤特异性来提高安全性，通过TRAIL基因的补充、Bcl-2基因的干扰以及溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的裂解等多方面协同作用来提高治疗效果。为了克服siRNA在实际应用上容易分解这一难题，我们将人工合成的、可表达siRNA序列的Bcl2 microRNA (smRNA) 表达盒置于TRAIL基因的3’非翻译区，应用hTRTP启动子，能够驱动Bcl-2 smRNA表达盒在肿瘤细胞中特异性的表达。为了解决治疗的靶向性问题，改造获得了端粒酶逆转录酶启动子（hTRTP）的优化形式，克隆了肿瘤抑制基因hWWOX及缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的氧依赖降解结构域（ODD），构建了新的融合蛋白的质粒，并包装成转录和翻译后双调控的腺病毒载体，从而形成一种肿瘤基因治疗的双调控策略。MicroRNA在肿瘤发生、发展过程中起重要的作用，课题组首次鉴定了has-miR-145在人类结肠癌中的两个全新的靶基因：Fli-1与DFF45，并发现miR-139通过直接负性调控RAP1B基因的表达从而抑制结肠癌的生长。. .本课题组还长期与美国斯坦福大学及法国格勒诺布尔约瑟夫•傅立叶第一大学合作，在肿瘤中胰岛素样生长因子2（IGF2）的印记丢失及Decoy CTCF介导的染色体空间构象改变； NADPH氧化酶4的首个单克隆抗体性质等方面进行了合作研究。. 每年我们都选派1-2名研究生去斯坦福大学进行 1-2 年合作研究，从事与本项目相关的毕业博士4名，目前还有博士研究生2名从事与本课题相关的实验研究工作。 .在此项目的资助下已在Cancer, Int J Cancer, IOVS , IJCB, JCB等SCI收录杂志上发表论文八篇，总影响因子（IF）超过30。