铜绿假单胞菌中c-di-GMP信号途径的调控机制及其与慢性感染的关系

The second messenger c-di-GMP plays key roles in P. aeruginosa chronic infection via directly controls the transition between planktonic and biofilm lifestyle. Previous studies and our recent research show that some key regulators, including the Gac/Rsm signaling system and the global regulator AlgR, act on the upstream of c-di-GMP signaling system and influence P. aeruginosa pathogenicity. This proposal is designed to identify the key regulators that affect the intracellular c-di-GMP concentration from the whole genome through cdrA-lux reporter. The promoter expression and gene knockout library of c-di-GMP metabolism related genes will be constructed and the function and regulatory mechanism of the key regulators will be further investigated. These results will expand our fundamental understanding of the mechanism of P. aeruginosa biofilm formation and chronic infection, which will provide a theoretical basis for the development of novel antipathogenic drugs targeting c-di-GMP signaling system for prevention of the bacterial infections.

第二信使c-di-GMP对铜绿假单胞菌慢性感染的产生具有关键的调控作用，该信号分子在细胞内浓度的变化直接影响着铜绿假单胞菌从浮游状态到生物被膜状态的转变。文献和我们最近的研究工作表明，在c-di-GMP信号系统上游存在一些关键的调控因子，如Gac/Rsm信号系统以及全局调控因子AlgR，它们可作为c-di-GMP信号系统的输入信号来影响铜绿假单胞菌的致病过程。本项目拟通过构建c-di-GMP信号分子浓度检测报道体系cdrA-lux，在全基因组水平上筛选影响细胞内c-di-GMP信号分子浓度的关键调控因子，构建c-di-GMP代谢相关基因的启动子文库及敲除突变体库，并对筛选出来的关键蛋白进行功能及调控机理研究。研究结果将有助于深入了解铜绿假单胞菌生物被膜形成及慢性感染发生的机制，并为开发以c-di-GMP信号系统为靶点的新型抗菌药物，控制病原菌的感染提供理论基础。

铜绿假单胞菌是临床上常见的条件致病菌，该菌在慢性感染过程中极易形成生物被膜并产生耐药性。第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）是生物被膜形成过程的关键调控因子。本项目通过转座突变的方法在全基因组水平上筛选了影响细胞内c-di-GMP信号分子浓度的上游调控基因，并在此基础上对这些关键基因的功能和调控生物被被膜形成的机制进行了研究。通过筛选15000个转座突变体，项目最终确定了14个参与调控c-di-GMP信号分子的基因。其中全局调节子AlgR对c-di-GMP的合成具有明显的调控作用。当algR基因突变后，胞内c-di-GMP的水平较野生型有显著降低，同时生物被膜的形成也明显下降。进一步研究结果显示AlgR可通过直接结合c-di-GMP代谢酶基因mucR的启动子来控制c-di-GMP信号分子的合成。此外，项目还对群体感应系统抑制子RsaL的晶体结构和调控生物被膜产生的机制进行了研究，并找到了RsaL的两个新的靶基因pqsH和cdpR，RsaL可通过调控pqsH基因的表达来影响生物被膜的形成。项目还对RsaL的晶体结构进行了解析，确定了RsaL与靶DNA的相互作用机制。这些研究结果使我们对c-di-GMP信号通路的调控机制以及生物被膜的形成机制有了更深入的认识，同时也为临床治疗方案的优化和新型抗菌药物的筛选提供了理论依据。