家蚕特异性扩增基因Pxts在病菌免疫应答中的功能及作用机制研究

Prostaglandins (PGs) play an important role in cellular immune responses and pathophysiological processes. There are a large number of PGs in the silkworm, but the key genes and the mechanism of PGs synthesis have not yet been clarified, which greatly restricts the prevention and control of the virus disease of the silkworm. The latest discovery of cell adhesion protein (Pxt) may be the key enzyme in the synthesis of insect PGs. Previous studies showed that two Pxts genes (BmHpx9 and BmHpx10) were highly expressed under the induction of BmEC and BmNPV, respectively. Based on the existing work, this project intends to explore the characteristics of Pxts, construct the spatial and temporal expression profiles and immune-induced expression profiles, and preliminarily screen Pxts genes related to PGs synthesis; The effects of the Pxts gene on the replication, nodule formation and blood cell extension of silkworm were studied. The silkworm with Pxts intervention was treated with immunomodulatory factors to study the effect of Pxts interference on the immune response of silkworm. At the same time, aspirin was used to treat silkworm to study its effect on the formation of silkworm nodules. The Pxts gene was determined to be related to the synthesis of PGs, and clarifying the mechanism of the Pxts in the silkworm immune response of the pathogen, it lays the foundation for the cultivation of resistant varieties and the biological control of the pests.

前列腺素（PGs）在细胞免疫应答和病理生理过程中发挥重要作用。家蚕中含有大量PGs，但其PGs合成的关键基因及合成机制至今尚未阐明，极大限制了家蚕病毒病的防治。最新发现细胞粘附蛋白(Pxts)可能是昆虫PGs合成的关键酶。研究表明2个Pxts基因（BmHpx9和BmHpx10）分别在BmEC和BmNPV诱导下高表达。本项目拟在已有工作基础上对Pxts特征进行探索，构建时空表达谱和免疫诱导表达谱，初步筛选与PGs合成相关的Pxts基因；通过个体内干涉和过表达Pxts基因，研究其对染毒后家蚕病菌复制、结节形成和血细胞延展的影响。采用免疫调节因子分别处理Pxts干涉后家蚕，研究其对Pxts干涉后家蚕免疫反应的影响。同时，利用阿司匹林处理家蚕，研究其对家蚕结节形成的影响，确定与PGs合成相关的Pxts基因，阐明Pxts基因在家蚕病菌免疫应答中的作用机制，为培育家蚕抗性品种及害虫的生物防治奠定基础。

前列腺素（PGs）在免疫应答和病理生理过程中发挥重要作用。家蚕中含有大量PGs，但并为发现合成PGs的关键酶COX，其合成机制至今尚未阐明，极大限制了家蚕病毒病的防治。因此，对家蚕Pxts基因的功能研究具有重要意义。本研究通过生物信息学方法及表达分析筛选获得与免疫相关的2个家蚕Pxts基因，通过序列分析、进化分析、免疫表达谱分析、RNA干涉及过表达后功能分析等对家蚕Pxts基因进行鉴定，并分析其在家蚕免疫方面的作用。主要结果如下：（1）Pxt1基因编码488个氨基酸，与人类的COX和其他昆虫的Pxts基因蛋白序列高度同源，功能性结构位点高度保守，同属于过氧化酶超家族。信号肽剪接位点位于第19位氨基酸丙氨酸和第20位氨基酸缬氨酸之间，预测的Pxt1蛋白理论等电点为4.79，理论质量为54.32kD。Pxt2基因编码592个氨基酸，与昆虫的Pxts基因蛋白序列高度同源，功能性结构位点高度重复，同属于过氧化酶超家族。信号肽剪接位点位于第16位氨基酸甘氨酸和第17位氨基酸缬氨酸之间，预测的Pxt2蛋白理论等电点为5.01，理论质量为65.95kD。（2）对Pxt1和Pxt2基因在各个组织表达情况进行研究发现，Pxt1和Pxt2在各个发育阶段均有表达，BmNPV诱导后所有发育阶段及组织表达均显著升高。（3）沉默Pxt1和Pxt2导致了化蛾率，结茧率，蚕卵个数，蚕丝量和寿命均受到一定程度的抑制。细胞免疫反应分析发现，沉默Pxt1和Pxt2使结节数和血细胞迁移数均减少，PGs可以使Pxt1和Pxt2的干涉作用大大降低，从而使结节增多，但花生四烯酸（AA）不能使干涉作用失效。干涉家蚕Pxt1和Pxt2基因后，免疫通路相关基因都出现了不同程度的下调表达。（4）对Pxt1和Pxt2基因进行克隆、体外表达、蛋白纯化后进行鉴定，将纯化后蛋白注射家蚕后发现其会使家蚕酚氧化酶活性升高，细胞免疫反应分析结果与低表达结果正好相反，即Pxt1和Pxt2与家蚕PGs合成相关，并在免疫应答方面发挥重要功能。