ocnus调控果蝇雄性生殖细胞发生的机制研究

The development of germ cells involves a series of complex processes, including cell proliferation, migration, maintenance and differentiation of stem cells. Ocnus (ocn) is highly expressed in the testis of Drosophila melanogaster. However, its role and mechanism in the development of male germ cells are not clear. Ocn protein contains janus domain. The homologue of Ocn in mammals is phosphohistidine phosphatase (PHPT1). Recent studies have shown that PHPT1 plays an important role in cell migration. Our previous work revealed that knockdown of ocn in fly testes resulted in much smaller size of testes containing no germ cells. This project intends to first investigate the role of ocn in the development of male germ cells in D. melanogaster by gene knockout/knockdown and immunofluorescence staining, and then identify the differrentially expressed proteins and differrentially phosphorylated proteins by comparative proteomics and phosphorylated proteomics. Finally we will study the functional pathway of ocn by gene mutation, EMSA, and pull down. This research may not only discover a new pathway and enrich the theory of the mechanism of germ cell development in animals, but also provide clues for the study of human spermatogenesis, cell migration and other related diseases, thus has important theoretical significance and potential application value.

生殖细胞的发生涉及细胞增殖、迁移、干细胞的维持和分化等一系列复杂的过程。ocnus (ocn)在果蝇精巢中高表达，但其在雄性生殖细胞发生过程中的作用及机制还不清楚。Ocn蛋白含有janus结构域，在哺乳动物中的同源物是磷酸组氨酸磷酸酶（PHPT1），PHPT1在细胞迁移过程中起重要作用。本课题组前期发现，ocn在果蝇精巢敲降后导致精巢体积变小，其中完全缺乏生殖细胞。本项目拟先采用基因敲除/敲降、免疫荧光染色等方法研究ocn在果蝇雄性生殖细胞发生过程中的作用，然后用比较蛋白组学/磷酸化蛋白组学鉴定ocn突变后发生差异表达及差异磷酸化的蛋白，再用基因突变、EMSA、Pull down等方法研究Ocn的作用途径。本研究不仅可望在雄性生殖细胞发生过程中发现一条新的信号通路，丰富动物生殖细胞发生调控机制的理论，还可为人类精子发生、细胞迁移等相关疾病的研究提供线索，具有重要的理论意义和潜在应用价值。

生殖细胞的发生涉及细胞增殖、迁移、干细胞的维持和分化等一系列复杂的过程。课题组在研究内共生菌沃尔巴克氏体（Wolbachia）感染对果蝇精子发生的影响时，发现Wolbachia感染导致果蝇精巢中ocnus（ocn）基因表达下调。由于Wolbachia感染的雄性果蝇与正常未感染的雌性果蝇交配后，胚胎的孵化率很低，提示ocn可能在雄性生殖方面发挥重要作用。ocn在果蝇精巢中高表达，但其在雄性生殖细胞发生过程中的作用及机制还不清楚。本课题组前期发现，ocn在果蝇精巢敲降后导致成体精巢体积变小，其中完全缺乏生殖细胞。本项目采用基因敲降/敲除、免疫荧光染色、电子显微镜、Pull down以及体外细胞转染等方法研究了ocn在果蝇雄性生殖细胞发生过程中的作用，发现ocn敲降并不影响果蝇胚胎期生殖细胞的特化和迁移，但在幼虫阶段生殖细胞逐渐减少。比较蛋白组学/磷酸化蛋白组学分析发现，ocn敲降后成蝇腹部差异表达蛋白606个、差异磷酸化的蛋白153个，其中Slmap、Cyt-c1L、Dany、CG9920、AK-3、RpL36等的蛋白表达水平以及与JAK-STAT途径相关的mask和wdp等的磷酸化蛋白表达水平都由于ocn敲降而发生显著下调，基因突变研究证明，Slmap、Cyt-c1L、Dany、CG9920、AK-3、RpL36等都在果蝇精子发生过程中起重要作用，其敲降或/和敲除都导致精子发生异常及雄性不育或育性严重下降。进一步研究发现，ocn可以通过抑制stat92e进入细胞核，进而调控其靶基因的表达，即通过负调控JAK-STAT途径调控果蝇生殖细胞的发育过程。此外，通过该项目的研究还发现，Wolbachia感染增强了果蝇的代谢，且引起果蝇精巢蛋白发生广泛的去泛素化效应。本研究在雄性生殖细胞发生过程中发现一条新的负调控JAK-STAT信号通路，丰富了动物生殖细胞发生调控机制的理论，在人类精子发生、细胞凋亡等相关疾病的研究领域也可提供新的线索，具有重要的理论意义和潜在应用价值。