超临界流体技术构建共载NGF和miR-222的丝素蛋白多孔支架及其调控神经干细胞分化的研究

In the field of neural tissue engineering, silk fibroin (SF) scaffolds prepared by traditional methods suffer from poor interconnected pore with nanofibrous network. Moreover, using growth factor or miRNAs separately undergo low stability and therapeutic efficiency. In order to overcome these problems, this study aims to develop NGF and miR-222 loaded silk fibroin porous scaffolds by the supercritical fluid technology. Firstly, chitosan nanoparticles (CSNPs) containing miR-222 will be prepared by complex coacervation, and then the miR-222-CSNPs will be embedded in NGF encapsulated silk fibroin porous scaffolds by supercritical CO2 assisted phase separation. In this process, the fructose particles will be used as porogen. The resulting scaffolds possess interconnected pore with nanofibrous network. Then the properties of these scaffolds include physical and chemical properties, mechanical property, the drug load and release properties of NGF and miR-222 and biocompatibility will be characterized. Furthermore, the effects and mechanism of scaffolds on differnentiation of neural stem cells (NSCs) into neuron will be measured to investigate the mechanism of combined treatment of NGF and miR-222. This study will provide a novel strategy to treat nerve injury.

针对目前制备支架存在的孔洞贯通性差和难于获得纳米纤维表面、单一生长因子或miRNAs治疗神经系统损伤时存在着的稳定性低和疗效不佳的问题，本研究拟采用超临界流体技术构建共载NGF和miR-222的丝素蛋白多孔支架。首先采用复凝聚法制备负载miR-222的壳聚糖纳米颗粒，再用超临界CO2辅助相分离法以果糖为致孔剂，制得miR-222以被壳聚糖纳米颗粒包覆的形式镶嵌在负载NGF的丝素蛋白多孔支架上，获得具有孔洞相互贯通、表面呈纳米纤维网状结构，并实现NGF和miR-222的联合缓释治疗。重点考察支架的理化性质及NGF和miR-222的载药量和缓释规律，评价支架的生物相容性，研究支架调控NSCs分化为神经元的效果和作用机制，阐明NGF和miR-222的联合作用机制，并为治疗神经损伤提供了一种新的方案。

中枢神经损伤是公认的疑难病之一。由于损伤部位的细胞微环境不利于神经元再生，从而导致中枢神经损伤后难以自我修复。神经干细胞具有自我再生和分化为神经元的能力，因此用神经干细胞移植疗法来治疗中枢神经损伤具有很大的希望，而这种方法存在的主要问题就是如何使神经干细胞定向、高效的分化为神经元。.针对以上问题，本课题采用超临界二氧化碳流体技术，通过添加致孔剂和丙酮，成功制备出了具有相互贯通的多孔结构和模拟细胞外基质纳米纤维网状结构的丝素蛋白仿生支架，并研究了各种参数对丝素蛋白仿生支架结构和性能的影响。采用离子凝胶法制备了负载miR-222的壳聚糖纳米颗粒，利用多巴胺对丝素蛋白支架进行表面修饰后，接枝负载miR-222的壳聚糖纳米颗粒，然后研究了miR-222对神经干细胞分化的调控作用。.实验结果表明，丙酮是形成纳米纤维网状结构的关键因素。丝素蛋白浓度，致孔剂粒径，丝素蛋白/致孔剂质量比和超临界二氧化碳的压力对支架的纳米纤维网状结构没有显著性影响，但是对丝素蛋白仿生支架的多孔结构有影响。丝素蛋白/致孔剂质量比是影响丝素蛋白仿生支架孔隙率和力学强度的主要因素，通过改变丝素蛋白/致孔剂质量比，可以调控支架的孔隙率和力学强度。之后以神经干细胞为细胞模型，通过细胞黏附实验、Calcein-AM/PI死/活细胞染色实验和细胞增殖实验，发现丝素蛋白仿生支架可以在一定程度上促进神经干细胞的黏附和增殖，具有良好的生物相容性。.负载miR-222的壳聚糖纳米颗粒的平均粒径为（261.567 ± 5.367）nm，单分散性指数为0.203 ± 0.079。TEM结果显示，负载了miR-222的壳聚糖纳米颗粒表面粗糙，有颗粒状突起。通过琼脂糖凝胶电泳实验测得壳聚糖纳米颗粒对miR-222的载药率为96.4 %，表明壳聚糖纳米颗粒可以有效的负载miR-222。.丝素蛋白支架经过多巴胺修饰后，亲水性得到提高，并且能够促进神经干细胞黏附与增殖。XPS实验结果表明，多巴胺改性丝素蛋白支架成功接枝负载miR-222的壳聚糖纳米颗粒。实时定量荧光PCR分析和蛋白质免疫印迹分析结果表明，miR-222对神经干细胞的分化具有一定的调控作用，能在一定程度上促进神经干细胞分化为神经元。.本项目有助于为治疗神经损伤开发一种新型的高效、无毒的缓释支架载体以满足基于miR-222的核酸治疗，为治疗神经损伤提供一种新的思路。