PTEN启动子甲基化与乳腺癌他莫昔芬耐药的相关性及其分子机理研究

Tamoxifen (TAM) is a standard endocrine therapy for breast cancer patients with positive estrogen receptor/progesterone receptor. However, TAM resistance is a serious clinical problem, resulting in failure of treatment for breast cancer. To improve treatment efficiency, it is urgent to develop novel predictive and prognostic biomarker of TAM for patients with breast cancer. PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome Ten) gene is a novel tumor suppressor. Clinical studies have showed that reduction of PTEN expression is associated with poor prognosis of breast cancer patients treated with TAM. And in vitro and in vivo experiments showed that PTEN promoter methylation is involved in TAM resistance in breast cancer. However, it is not clear whether PTEN promoter methylation is correlated to TAM resistance in women with breast cancer. Mechanisms underlying PTEN-induced TAM resistance have not been well elucidated yet. Our previous study found that the proportion of PTEN methylation in serum from patients with breast cancer has a significant correlation to that in tumor tissues, indicating aberrant methylated PTEN in serum samples, in stead of tumor tissue, might represent a promising biomarker for breast cancer. In this study, we will analyze PTEN expression and promoter methylation in tumor tissue from breast cancer patients treated with TAM, and their correlation to prognosis. We will also estimate whether PTEN methylation pattern in serum, which are collected before and after treatment of TAM, is able to predict prognosis of breast cancer patients. And in vitro experiments will be conducted to reveal the role of PTEN promoter methylation on TAM resistance and related cell signaling pathways in breast cancer cells. Our study will provide important translational research basis for development of novel predictive and prognostic biomarker of TAM for women with breast cancer.

他莫昔芬（tamoxifen，TAM）是激素受体阳性乳腺癌的标准内分泌治疗之一。但由于TAM耐药性问题常导致临床治疗失败，故迫切需要为乳腺癌患者开发理想的TAM疗效预判生物标志物，提高治疗效率。临床研究表明抑癌基因PTEN蛋白表达下降与乳腺癌TAM预后不良相关，也有基础实验表明PTEN启动子甲基化参与诱导乳腺癌TAM耐药。但尚无乳腺癌PTEN启动子甲基化与TAM耐药相关性的报道，其分子机理也未阐明。我们的前期研究发现乳腺癌患者血清和肿瘤组织的PTEN甲基化水平具有相关性，提示血清可能代替组织成为检测PTEN甲基化的新策略。本研究拟分析乳腺癌妇女肿瘤组织中PTEN蛋白表达与甲基化状态，以及TAM治疗前后血清PTEN甲基化的变化，是否与TAM治疗预后相关；拟研究PTEN甲基化在乳腺癌细胞他莫昔芬耐药中发挥的作用及其信号传导通路，从而为开发TAM疗效预判标志物提供转化医学研究依据。

他莫昔芬（tamoxifen，TAM）是激素受体阳性乳腺癌的标准内分泌治疗之一。但TAM耐药性问题常导致临床治疗失败，故迫切需要为乳腺癌患者开发理想的TAM疗效预判生物标志物。本研究纳入了1998.1~2013.1在四川大学华西医院诊治的非转移性激素受体阳性的乳腺癌妇女，接受TAM单药辅助治疗满5年，或直到疾病进展。最终纳入60例预后良好，45例预后不良（疾病进展）患者。应用免疫组化技术与焦磷酸测序技术，分析了肿瘤组织中PTEN蛋白表达及其启动子甲基化与TAM治疗预后的相关性。应用全基因组亚硫酸氢盐测序技术（WGBS），比较6例不同预后的配对患者血浆游离DNA PTEN基因及其上游5k区域的CpG位点平均甲基化水平。利用成功建立的两株TAM耐药人乳腺癌细胞株（MCF7-TAMR和BT474-TAMR），研究PTEN基因调控TAM耐药性的分子机理。 我们发现：（1）预后不良组肿瘤PTEN高表达比例显著低于预后良好组（8.9%vs. 28.3%）。PTEN高表达是TAM治疗后复发的保护因素(调整后HR=0.2)。肿瘤PTEN基因启动子（-819 ~ -787）高甲基化组的七年DFS率和七年OS率均显著低于低甲基化组（DFS：50.1%vs.69.7%；OS：82.2%vs.95.4%）。高甲基化组的TAM治疗后复发风险显著提高（HR=2.18）。预后不良组的该序列CpG位点4甲基化水平显著高于预后良好组，并且该位点甲基化水平与PTEN蛋白表达呈负相关。（2）WGBS显示预后不良组血浆PTEN基因及其启动子平均甲基化水平有高于配对预后良好组的趋势。（3）干扰PTEN表达能够减弱TAM对亲代株的生长抑制作用；PTEN可能通过调节MAPK通路，mTOR/p70S6K通路及其下游分子P53和Cyclin D1影响乳腺癌细胞对TAM的耐药性。结论：（1）肿瘤组织PTEN蛋白表达及其启动子甲基化与激素受体阳性非转移性乳腺癌患者的TAM辅助治疗预后具有相关性。（2）乳腺癌患者血浆PTEN基因在TAM治疗预后不良组中呈现出较高的甲基化水平趋势。（3）PTEN可能通过调节MAPK通路和mTOR通路影响乳腺癌细胞对TAM的耐药性。本研究为TAM治疗乳腺癌的预后判断提供了潜在的蛋白与表观遗传学生物标志物，对改善激素受体阳性患者的预后具有重要临床意义。