调控山核桃LFY基因的蛋白结构与功能分析

成花是植物发育过程的重要事件，受环境信号和植物体自身发育的影响。LFY是成花的关键基因，调控花分生组织发生。山核桃雌雄同株，雌雄花发生存在时间与部位上差异，成花存在异质性。项目组克隆到调控山核桃（Carya cathayensis）LFY基因的启动子，经分析其具有对光、温、激素等响应的一些调控元件，为探明山核桃雌雄花发生的信号来源，理解启动子调控元件的生物学意义，本项目以CcLFY启动子及其调控元件为探针，利用免疫共沉淀方法钓出与启动子结合的蛋白，运用生物信息学和蛋白组学方法鉴别与成花相关的蛋白，解析其结构与功能，揭示山核桃成花的分子机理，为人为调控开花、提升产量打下基础。

本研究通过RACE等技术克隆了与CcLFY调控相关的MADS-box和CcCOP1 E3连接酶等基因，奖获得的基因进行了同源性及结构分析，通过定量PCR分析了在山核桃不同发育阶段的表达情况，利用酵母双杂、凝胶阻滞等技术分析了各转录因子间的相互作用，利用原核表达、结构分析等手段解析其晶体结构，进一步了解相关基因的功能。结果显示：.1、多序列比对和进化树分析表明，得到的CcMADS属于典型的植物MADS-typeⅡ，分别命名为CcAP1 (AHI85952), CcSVP (AHI85951), CcSOC1 (AHI85950), CcTM；这些MADS转录因子具有明确的MIKC分区，其中有高度保守的M区和相对保守的K区。.2、定量结果可知，CcTM不同组织的实时定量PCR (qRT-PCR) 实验显示，CcTM在根、茎中未检测到表达，在叶、花芽中大量表达，尤其是花芽中高出7-10倍，暗示其可能在成花过程中发挥作用。CcSVP基因的表达贯穿山核桃雌雄花芽发育的全过程，在雌花芽中3月中旬的表达量相对较高，在雄花芽中5月初到7月下旬表达量相对较高。.3、酵母双杂交 (H2Y) 实验表明，山核桃AP1和SVP、AP1和FLC1、AP1和FLC2、SVP和FLC1、FLC1和FLC2组合蛋白两两相互作用，且CcAP1、CcSVP、CcFLC1、CcFLC2存在自我相互作用。CcSOC1表现一定程度的“惰性”，不与包括自己在内任何CcMADSs相互作用。.4、CcSOC1结构域的H2Y实验表明，M区的存在似乎阻碍了CcSOC1二聚化的形成，K区的存在表明了CcSOC1仍然有形成同源或异源二聚体的潜力。杂交酵母的蛋白免疫印迹 (WB) 检测，表明目的蛋白成功在酵母中表达，且表达量足以支持其表现应有的阳性表型。采用WB对山核桃CcSVP不同组织（雌雄花芽）不同时期的表达水平进行检测，发现山核桃CcSVP在不同发育时期表达水平不同，大体呈现峰形变化。.5、 pSUMO为表达载体，Rosetta为表达宿主，成功构建了不同缺失片段结构域的原核表达载体，分别为CcSVP(1-227aa)、CcSVP(1-180aa)、CcSVP(1-170aa)及CcSVP(1-160aa)等4个。获得4个可溶蛋白，然后大量诱导并纯化得到了较高纯度(>90%)的蛋白。本实验将纯化得到的CcSVP蛋白与特