青花菜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白BoPGIP1基因的功能验证及其启动子序列研究

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）基因普遍存在于植物中，其编码蛋白具有抵抗病原菌入侵的作用，该基因已经成为植物分子抗病育种研究中的重要对象之一。在前期的研究工作中，本课题组已从青花菜中克隆到了一个新的PGIP基因BoPGIP1，为了进一步研究该基因功能及表达调控机制，本项目拟在前期工作的基础上通过Real-time PCR技术分析BoPGIP1基因的组织表达（叶片、花茎、花、根）和诱导表达（病原菌诱导、SA、JA、乙烯、低温、机械损伤）特征，并将该基因定向克隆到植物表达载体pCambia1301,构建成由组成型启动子CaMV35S启动的过表达载体，通过农杆菌介导法转化青花菜和番茄，以及将构建RNAi载体转化青花菜，进行该基因的功能验证；同时，利用Tail-PCR技术克隆BoPGIP1基因的启动子，构建BoPGIP1启动子：GUS融合表达载体通过花浸泡法转化拟南芥，研究启动子活性和功能。

多聚半乳糖醛酸酶醛酸酶抑制蛋白（PGIP）是一种重要的植物防御蛋白，能专一性地抑制病原菌多聚半乳糖醛酸酶活性，有效地抑制病害的发生，因此在植物的抗病育种中得到广泛应用。在前期的研究工作中，本课题组已从青花菜中克隆到了一个新的PGIP基因BoPGIP1，为了进一步验证该基因在抗病反应中的功能，本项目对青花菜BoPGIP1的功能进行了详细的研究并获得如下结果：（1）通过RT-PCR技术分析了BoPGIP1基因的组织表达和诱导表达特性，结果表明BoPGIP1基因在根和花蕾中表达，在叶、茎和角果未检测到表达信号；同时SA、MeJA和损伤胁迫处理均能诱导该基因的高效表达；（2）成功构建了BoPGIP1基因的过表达载体pCambia1303和RNAi载体，通过花序侵染法转化拟南芥，获得转基因阳性植株，对转基因株系接种灰霉菌进行初步的抗性分析，结果发现转基因株系的抗病性明显高于野生型拟南芥；同时对抗性植株的生理生化指标进行了测定，为揭示抗性机理提供理论依据；（3）成功构建了BoPGIP1基因的原核表达载体pET28a-BoPGIP1，获得高效表达BoPGIP1基因的重组大肠杆菌BL21(pET28a-BoPGIP1)，对重组大肠杆菌BL21（pET28a-BoPGIP1）的抗逆性进行分析，结果表明，重组菌对NaCl（0.4mol/L）、NaHCO3(0.2 mol/L)和PEG6000(20%)的抗性明显高于对照菌株BL21（pET28a）。本项目在国内外核心期刊发表研究论文3篇（录用1篇），获得软件著作权1个。