凝血栓蛋白-1对内皮祖细胞成血管功能的影响及分子机制

内皮祖细胞（EPCs）具有增殖，分化为成熟内皮细胞的潜力，参与血管修复及新生血管形成。EPCs移植是治疗缺血性心肌病的新方法，但研究发现EPCs参与形成新生血管的比例低，因此如何促进移植EPCs参与血管形成是改善细胞移植作用的关键。凝血栓蛋白-1（TSP-1）为细胞外基质（ECM）的组成成分之一，参与调节EPCs归巢至缺血区后的成血管功能。新近研究发现，TSP-1有促进主动脉血管内皮细胞的成血管作用。TSP-1对EPCs是否有相似的的直接作用？目前尚无报道。本研究拟在细胞培养模型上观察TSP-1对EPCs成血管能力的作用，并探索内皮细胞表面受体（CD36，β1整合素）及分子信号通路（MAPK、ERK1/2）在TSP-1调节EPCs成血管过程中所起作用，为提高EPCs移植效率提供新的调控途径。

研究目的：冠状动脉侧枝循环的建立有助于保护冠心病患者的心脏功能。心肌缺血后凝血栓蛋白-1（TSP-1）在缺血区域表达增加，参与调控侧枝循环的建立。本研究首先探索了TSP-1是否能抑制内皮祖细胞（EPCs）的成血管功能。其次，进一步研究血清TPS-1水平在至少有一支冠状动脉慢性完全闭塞（CTO）且存在不同水平侧枝循环的患者中是否有差异。.研究方法和结果：自人脐血中分离早期和晚期EPCs,通过Matrigel成血管试验研究TSP-1对EPCs的体外成血管作用是否存在剂量依赖性效应。研究发现TSP-1(5μg/ml)预干预早期EPCs 1、6、12小时可显著抑制早期EPCs参与内皮细胞形成小管结构（干预1小时：83.3±11.9比 50.0±10.1个/视野;干预6小时：161.7±12.6 比124.0±14.4个/视野；干预12小时： 118.3±12.6 比68.0±20.1 个/视野, p<0.05)。TSP-1（1μg/ml）同时抑制晚期EPCs小管形成（6653.4±422.0 比 5552.8±136.0μm/高倍镜视野, p<0.05），该抑制效应在5μg/ml时更明显（6653.4±422.0比 2118.6±915.0μm/高倍镜视野 p<0.01）。通过小干扰RNA（siRNA）深入研究其中机制。体外研究发现，CD47 siRNA 显著减弱TPS-1对晚期EPCs成血管的抑制作用，且CD47抗体干预也可达到类似效果。之后，通过研究CD47下游信号通路发现，TSP-1通过CD47调节血管内皮生长因子（VEGF）诱导的VEGFR2磷酸化。此外，在CTO合并不同程度侧枝循环患者的血清TSP-1水平研究发现，TSP-1在侧枝循环良好患者中较侧枝循环较差患者中反常性升高（612.9±554.0比224.4±132.4ng/ml, p<0.05）。.结论：TSP-1体外抑制早期及晚期EPCs成血管能力。这种抑制效应由TSP-1与CD47相互作用介导，最终下调VEGFR2磷酸化。在CTO患者中，侧枝循环较差的情况下存在自我调节作用，表现为具有抑制血管生成作用的TSP-1表达降低，最终促进侧枝循环形成。本研究为探索EPCs参与心肌缺血后侧枝循环建立的机制提供依据，为今后干预此病理生理过程，促进心肌血供恢复打下基础。