甜菜夜蛾甲维盐多因子抗性的分子机理

Beet armyworm, Spodoptera exigua, is one of the most serious pests of vegetables and other summer/autumn crops. Emamectin benzoate is the major insecticide for its control. We have already selected a pair of near-isogenic lines of S. exigua, one susceptible strain (WH-S) and one resistant strain (WH-EB) which has 1200-fold resistance to emamectin benzoate. Genetic analysis showed that resistance to emamectin benzoate in WH-EB is controlled by incompletely dominant, polygenic factors. Considering multiple target sites of emamectin benzoate, genetic mapping will be employed to identify candidate resistance genes in WH-EB. The resistant strain (WH-EB) will be crossed with the susceptible strain WH-S, and F1 progeny is backcrossed with WH-S. Two mapping groups will be constructed from the backcross progeny. Linkage groups will be identified based on SNP markers originated by RAD-seq. Resistance QTLs will be allocated by fine mapping. With integration of BAC library screen, chromosome walking and synteny among lepidopteran genomes, candidate genes responsible for resistance will be identified. Depending on the nature of candidate genes, adaptive techniques of functional expression will be used to verify causal relationship between candidate genes and resistance. This study aims to elucidate polygenic resistance mechanisms of S. exigua to emamectin benzoate at molecular level, and provide theoretical basis for rational use and further exploitation of this kind of evironment-benign insecticides.

甜菜夜蛾是我国蔬菜和其它夏秋作物上的重要害虫，甲维盐是控制此类害虫的主要药剂。前期研究中已建立了对甲维盐具有1200倍抗性的近等基因系（WH-EB），抗性遗传分析表明抗性为多基因控制的不完全显性遗传。鉴于甲维盐作用机制和抗性机理的多样性，本项目拟将抗性品系WH-EB与敏感品系WH-S杂交、回交，建立抗性基因的遗传作图群体，通过高通量测序筛选与抗性基因紧密连锁的SNP标记，构建分子标记连锁图，对抗性基因进行精细定位；然后，通过BAC 文库筛查、染色体步移、基因组的同线性，鉴定出候选的抗性基因；最后，比较抗性和敏感品系在这些基因上的差异，根据基因类型及变异特点，选择相应的方法进行功能验证，以期在分子水平上阐明甜菜夜蛾对甲维盐多因子抗性的分子机理，为这类高效低毒杀虫剂抗性监测预警及合理使用提供理论依据。

甜菜夜蛾Spodoptera exigua是世界性的重要农业害虫，间歇性暴发成灾，化学防治是控制其危害的主要手段。甜菜夜蛾对传统杀虫剂已产生了严重的抗性，甲维盐作为新型的大环内酯类杀虫剂成为防控甜菜夜蛾等害虫的主要药剂，但其作用机制和抗性机理尚不明确。本项目利用甜菜夜蛾对甲维盐高抗品系WH-EB，通过抗性基因的遗传定位、CRISPR/Cas9基因编辑技术、细胞表达和代谢产物分析等手段对其抗性的分子机理进行了深入的研究。首先比较了抗性和敏感品系甲维盐可能作用靶标谷氨酸受体（GluR）和γ-氨基丁酸受体（GABAR）的基因序列，没有发现与功能有关的变异，CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除甜菜夜蛾GABAR的Q型基因，也证实了它与甲维盐抗性无关。其次研究了甜菜夜蛾ABC转运蛋白SeP-gp，发现缺失4个核苷酸的SeP-gp基因敲除品系对阿维菌素和甲维盐的敏感性增加（~3倍），对其它杀虫剂敏感性无明显变化，说明SeP-gp基因的变化会导致甜菜夜蛾对阿维菌素和甲维盐产生一定水平的抗性。第三，通过对抗性基因的图位克隆，结合基因组同线性分析，将甜菜夜蛾甲维盐抗性基因定位到了Chr17上15-16Mbp区间；再通过精细定位并结合基因簇和单基因敲除试验，确定抗性基因为这一区域内细胞色素P450基因簇CYP9A上的CYP9A186，抗性品系中该基因存在F116V突变；利用昆虫细胞体外表达及代谢产物质谱分析，证实CYP9A186的突变型（116V）对甲维盐和阿维菌素具有较强的代谢能力，而野生型（116F）则没有相应的代谢能力。上述研究结果清楚表明，甜菜夜蛾细胞色素P450的CYP9A186基因F116V突变是对甲维盐产生高水平抗性的主要分子遗传学基础。田间调查发现，5个对甲维盐高水平抗性的甜菜夜蛾田间种群（抗性为212-388倍）中F116V的突变频率为80.36%-96.67%，且甲维盐抗性水平与抗性等位基因频率有显著的相关性（R2=0.98)，因此CYP9A186的F116V突变也是田间种群的主效抗性因子，通过田间种群抗性基因频率的检测可以预测甜菜夜蛾对甲维盐的抗性水平。本项目的研究结果首次阐明了甜菜夜蛾对甲维盐抗性的分子机理，为甲维盐的抗性监测预警及制定针对性的抗性治理策略提供了重要的理论依据，对其他鳞翅目害虫对甲维盐的抗性机理研究也提供了重要的借鉴。