中华蜜蜂囊状幼虫病毒编码siRNA及其RNAi抑制因子在免疫保护中作用

Chinese Sacbrood disease was also named as "bee cancer", causing death of individual bees and collapse of entire colonies. But there is no effective measure in the prevention and treatment of Chinese Sacbrood disease. The RNAi is a major antiviral defense mechanism in solitary insects. Therefore, based on high throughput sequencing of the siRNA of CSBV infecting Apis cerana, siRNA function and anti-CSBV RNAi systemic were analyzed using RNAi, EMSA, fluorescence in situ hybridization and so on, and the siRNA were detected in the host cytoplasm or nucleus. As same time, we analyzed CSBV suppressors of RNAi (VSRs), which CSBV has been evolved in order to evade the RNAi by VSRs . The CSBVSR was screened using the established VSRs model by adding different recombinant plasmids of encoding CSBV proteins. On the basis of above, the effects of CSBVSR on Dicer-like and RISC was studied by using Western blot, CO-IP and EMSA. It will lay the foundation for the pathogenesis and immune mechanism of CSBV, and the design and application of viRNA/dsRNA by elucidating the function of Chinese Sacbrood virus encoding siRNA and CSBVSR in immune protection.

中华蜜蜂囊状幼虫病俗称“蜂癌”，已对中华蜜蜂业造成了毁灭性打击，但至今仍无有效防治措施。鉴于RNAi是昆虫抗病毒免疫主要防御机制，本研究对感染CSBV的中华蜜蜂幼虫进行siRNA高通量测序，并对siRNA作用的靶基因进行预测，对靶基因调节作用进行研究，在此基础上，利用RNAi技术、EMSA技术和原味杂交技术等对siRNA通过自主RNAi和系统性RNAi机制发挥免疫保护作用进行研究。同时，CSBV为逃避宿主RNAi机制，进化产生了RNAi抑制因子，基于此，利用建立的RNAi模型筛选出有RNAi抑制作用CSBV蛋白质(CSBVSR)，并利用免疫印迹、CO-IP和EMSA等技术研究CSBVSR对Dicer-like和RISC影响。通过阐明siRNA和CSBVSR在免疫保护中的作用，为CSBV的发病机制、免疫机制研究和靶向siRNA/dsRNA设计应用奠定基础。

本研究对CSBV感染中华蜜蜂幼虫进行了高通量测序，结果表明感染CSBV 24h后，共有18 种miRNAs表达存在差异，其中12种上调，6种下调；在感染CSBV 48h后，共有47种miRNAs表达存在差异，其中30种下调，17种上调。通过对预测差异表达miRNA的候选靶mRNA分析显示，感染CSBV 24h与对照组差异表达miRNA共涉及854个靶mRNA，感染CSBV 48h与对照组差异表达miRNA共涉及2570个靶mRNA。同时对中华蜜蜂幼虫在CSBV感染过程中的分子响应机制和宿主抗病毒相关基因进行了深入分析。通过GO功能以及KEGG通路富集分析，表明，中蜂幼虫感染CSBV后DemiRNA能够极大地影响幼虫的生长、发育、代谢和免疫。同时根据研究目标，建立了针对内源性GFP和外源性Luc基因的RNAi模型，并以番茄丛矮病毒 P19 蛋白抑制短发夹 RNA 介导的 RNAi作用对模型进行验证。利用已经建立RNAi抑制因子模型，对CSBV 编码的结构蛋白VP1、VP2、VP3可能存在RNAi抑制功能的蛋白进行筛选，确定VP3蛋白为RNAi抑制因子，研究发现VP3蛋白通过抑制Dicer酶活性，发挥对RNAi的抑制作用。此外开展了对CSBV非编码区功能的研究，发现其3’UTR对靶基因具有抑制作用，随后进行了CSBV各个蛋白对3’UTR的调节作用的研究，其中RdRp与Helicase降低了3’UTR翻译抑制作用，可能在CSBV 感染过程中促进病毒的复制。通过酵母双杂交系统筛选出与VP1互作宿主蛋白，并进行体外验证和幼虫感染实验，证明Hsp70-c5能促进CSBV在幼虫中的复制，且在患感染CSBV的幼虫体内HSP70蛋白的表达上调，因此推测CSBV感染幼虫导致细胞应激，从而使HSP70表达量上调。在此基础上，密切联系生产实际，制备8株抗CSBV单克隆抗体，其中4F4和5D5单克隆抗体对CSBV存在中和作用，以此成功的建立了CSBV双抗夹心ELISA诊断方法；对影响我国养蜂业的主要蜂病毒DWV、CBPV、IAPV以及白头蛹也进行了研究。