盘基网柄菌细胞感受微小直流电场分子机制的研究

Correct sense of direction is fundamental to cell polarization, migration and growth. Amongst extracellular cues that give cells a sense of direction, electric fields (EFs) have been know for many decades to guide cell polarization (galvantropism) and cell migration (galvanotaxis). Importantly, the applicants demonstrated that an EF can override other well-accepted directional cues (i.e. contact inhibition release, wound void, and chemoattractants) to direct cell migration. However, the mechanisms for cells to sense the weak EFs are not known. In this proposal, we will use Dictyostelum discoideum as a model to establish a REMI library which include whole genome information. Then electroaxis changed mutants (Increased, decreased and anode electrotaxis mutants) will be screened by high-throughput screening technique. Finally, we will identify and characterize the genes required for directional sensing in an EF. The basic mechanisms revealed in this study should apply to other type of cells.

正确的细胞定向迁移是组织生长发育、伤口愈合及免疫反应过程中的关键因素。在众多的方向信号中，内源性微生物电场在伤口愈合过程中起到决定性因素。为此，内源性微小生物电场作为关键的细胞定向迁移信号之一，越来越受到人们的重视。然而，对细胞如何感受这一微环境生物电场信号的机制尚不清楚。在前期对电场指导细胞重要行为的大量研究基础上，本项目拟以模式生物盘基网柄菌为研究对象，构建涵盖全基因组的突变子库，利用自建的高通量筛选方法分离目的突变株，通过质粒营救获得基因信息，分子遗传实验选出关键基因并进行基因功能研究，最终揭示细胞趋电性的可能信号传导途径及分子机制。

正确的细胞定向迁移是组织生长发育、伤口愈合及免疫反应过程中的关键因素。在众多的方向信号中，内源性微生物电场在伤口愈合过程中起到决定性因素。为此，内源性微小生物电场作为关键的细胞定向迁移信号之一，越来越受到人们的重视。然而，对细胞如何感受这一微环境生物电场信号的机制尚不清楚。因此，本项目以模式生物盘基网柄菌为实验材料，用质粒pBRS-1构建了限制性内切酶介导整合的突变库（REMI），高通量筛选方法分离出趋电性显著降低或消失的突变株并进行质粒营救、同源重组的基因敲除等，最终筛选了18个目的基因，其中，forC-、rasD-、pi3k1-2-、Gγ-、Gα2-/Gγ-、car1-/car3-、Gβ-、DdFHα-、PKA-cat和gefU-基因缺陷株的趋电性方向显著降低，说明这些基因在盘基网柄菌细胞对胞外电场的感应和信号传递过程中发挥了关键的作用。除了基因筛选，我们还进行了转录组测序，结果显示电场刺激导致盘基网柄菌细胞154个基因的表达显著上调，158个基因的表达显著下调。GO聚类分析发现，上调基因主要参与氧化还原，因此我们通过药物处理（NAC和L-NMMA）和基因敲除等证明，活性氧在盘基网柄菌细胞的趋电性运动中确实发挥了重要的作用，这为利用生物电治疗肿瘤转移提供了理论基础；此外，下调基因主要分布在参与细胞发育上，因此，我们也通过电刺激后观察盘基网柄菌多细胞的发育，结果显示，外源直流电刺激导致盘基网柄菌细胞多细胞滞后。最后，为了在哺乳动物中应用我们的研究结果，因此，我们选择了盘基网柄菌细胞的piaA基因在哺乳动物细胞系HL-60中同源基因Rictor2作为目标基因，通过药物pp242处理可以抑制HL-60的趋电性，然而，通过基因沉默Rictor2则对趋电性的抑制不显著。这提示我们在低等生物和高等生物中，尽管基因是同源的，但是功能上可能存在差异，因此，在我们之后的研究中，需要结合高等生物细胞的实验才能更准确的为应用提供理论基础。