新型纳米荧光开关的构建及手足口病病毒同步检测技术研究

In our country, the incidence of the hand, foot and mouth disease is upgrading in recent years. The main pathogens caused HFMD are EV71 and CoxA16 viruses. Efficient and accurate detection of the target virus is a key of prevention of disease outbreak. However, it is difficult to satisfy hygiene inspection and testing requirements since the existing detection technology have certain limitations. In this study, we purpose to combine fusion protein technology, yolk antibody technology and nano-technology together to design a novel fluorescent nano-switch for the synchronous detection of EV71and CoxA16 viruses. The study includes: pre①paration, purification fusion protein and yolk antibody IgY;②synthesis of immunized gold nanoparticles and quantum dots;③Construction of FRET-based Nano-fluorescence switch;④ EV71 and CoxA16 qualitative and quantitative detection and evaluation of test results. The purpose is to develop the kit for HFMD viruses’detection with our own intellectual property.

近年来，手足口病在我国暴发流行呈上升趋势，其主要病原体是EV71和CoxA16病毒，高效准确检测这两种靶病毒是预防控制手足口病疫情的关键。目前的检测技术均存在一定的局限性，难以满足当前卫生检验的实际需要。本研究拟联合使用融合蛋白技术、鸡卵黄抗体技术和FRET技术构建新型纳米荧光开关，实现对EV71和CoxA16病毒的定性、定量同步检测。课题的主要研究内容包括：①制备、纯化EV71病毒和CoxA16病毒抗原融合蛋白和卵黄抗体IgY；②设计、合成免疫化金纳米粒子和量子点；③ 构建FRET纳米荧光开关；④待检样品中EV71病毒和CoxA16病毒的定性、定量检测及其效果评价。本课题研究的目的是设计制备具有我国自主知识产权和广泛应用前景的手足口病病毒检测试剂盒，借助荧光分光光度计实现对两种病原体的实时、同步、准确检测。

手足口病是由多种肠道病毒引起的常见传染病，我国手足口病暴发流行的主要病原体为肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16），由于该病毒对人群健康危害较大，因此，早期快速、特异性地监测EV71、CA16病原体并采取有针对性的预防控制措施，现已成为公共卫生研究的热点问题之一。传统的检测方法存在操作复杂、耗时耗力、灵敏度低、特异性差等缺点。因此，建立一种快速、灵敏且特异性好的手足口病检测方法十分必要。本课题利用金纳米粒子和量子点具有良好的生物相容性和易于表面修饰等优点，基于荧光能量共振转移(FRET)的原理，通过纳米生物探针和抗原的特异性免疫反应，实现EV71病毒和CoxA16病毒检测的快速、高效检测。.经过三年的研究，课题研究工作已完成，并取得预期的研究成果。课题总体研究工作简介如下：本课题完成了EV71、CA16型病毒卵黄抗体IgY的制备，其抗体纯度好、蛋白含量和抗体效价高，特异性良好，无交叉反应，可用于免疫生物探针的构建；设计、合成了表面功能化金纳米粒子和两种量子点，两种纳米粒子粒径均一、理化性质稳定、分散性良好，通过静电自组装将两种卵黄抗体偶联至金纳米粒子表面，得到能够特异性识别EV71、CA16的生物探针；应用FRET原理，构建两种靶病毒turn-on型“荧光开关”体系，并优化了实验条件，使体系的性能达到最佳，最后根据检测体系荧光颜色和强度变化，借助荧光光谱实现了临床样本中两种靶病毒的定性、定量检测。本研究建立的检测方法灵敏度高，特异性良好，无交叉反应，在实际检测工作中，仅需将经预处理后的待检样本分别加入不同荧光淬灭体系中，即可实现两种病原体的定性、定量检测。与传统病毒检测方法相比，该方法具有免预培养，免分离，免洗涤等优势，如能以检测试剂盒形式提供，将对手足口病的爆发期筛查诊断和临床治疗提供技术支持，同时为病人的早期诊断和治疗提供了实验室依据。研究成果已发表论文8篇；获得授权发明专利1项；培养2名博士和1名硕士研究生，完成了预定目标任务。