基于表面分子印迹技术的抗幽门螺杆菌生物粘附纳米给药系统的研究

本项目旨在构建一种基于表面分子印迹技术的抗幽门螺杆菌生物粘附纳米给药系统，并且该给药系统能较快地穿越胃粘液层到达幽门螺杆菌所在的胃上皮细胞间隙。选择表达于幽门螺杆菌表面的膜蛋白Lpp20抗原为目标分子，利用分子印迹技术将其活性片段多肽分子结合于纳米粒表面，随后再将多肽分子洗脱，使纳米粒表面留下特定形状和大小的Lpp20抗原活性片段多肽分子的"印迹"，形成与Lpp20抗原的特异性结合位点。当携载药物的分子印迹纳米粒到达幽门螺杆菌所在的胃上皮细胞间隙，纳米粒表面的"印迹"可帮助其与幽门螺杆菌表面的Lpp20抗原活性片段多肽分子发生"嵌合"，从而使纳米粒粘附于病菌表面并持续释放药物以杀灭幽门螺杆菌。这种表面分子印迹载药纳米粒的应用既可以保留类似"抗原-抗体"的特异性结合作用，又避免了抗体修饰的给药系统易产生的免疫原性和抗体活性损失的问题，是一种可以达到细胞/细菌水平的新型生物粘附纳米给药系统。

本项目选择表达于幽门螺杆菌表面的膜蛋白Lpp20 抗原为目标分子，利用分子印迹技术将其活性片段多肽分子结合于纳米粒表面，随后再将多肽分子洗脱，使纳米粒表面留下特定形状和大小的Lpp20 抗原活性片段多肽分子的“印迹”，形成与Lpp20 抗原的特异性结合位点。当携载药物的分子印迹纳米粒到达幽门螺杆菌所在的胃上皮细胞间隙，纳米粒表面的“印迹”可帮助其与幽门螺杆菌表面的Lpp20 抗原活性片段多肽分子发生“嵌合”，从而使纳米粒粘附于病菌表面并持续释放药物以杀灭幽门螺杆菌。这种表面分子印迹载药纳米粒的应用既可以保留类似“抗原-抗体”的特异结合作用，又避免了抗体修饰的给药系统易产生的免疫原性和抗体活性损失的问题，是一种可以达到细胞/细菌水平的新型生物粘附纳米给药系统。.在正式开展“基于表面分子印迹技术的抗H. pylori生物粘附给药系统”的研究之前，本课题首先以溶菌酶作为模板蛋白，以丙烯酰胺为功能单体、N, N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，采用反相悬浮聚合法制备了溶菌酶分子印迹微球，并进行了微球与模板分子的重结合实验，证明其达到了表面印迹的效果。所得溶菌酶分子印迹微球外观圆整，平均粒径在35μm左右，zeta电位约-30mV。微球对溶菌酶的吸附过程在40min内达到平衡。无论在单一蛋白质还是有其它蛋白质干扰的竞争环境中，印迹微球对模板蛋白溶菌酶都表现出特异性识别能力。.借鉴文献的做法，并结合前期溶菌酶表面印迹微球制备的经验，为达到“表面印迹”（surface imprinting）的目的，我们在亲水性模板NQA的末端连接一段脂肪酸长链，将其改性为两亲性分子，使其尽可能在制备过程中如同表面活性剂一样停留在油-水两相界面上，以形成NQA的表面印迹位点。除了前期采用的模板分子与印迹微球的宏观重结合实验方法，我们还引入了表面等离子共振法、“zeta电位差异法” 、荧光偏振技术等对表面印迹纳米粒的印迹效果进行评价，并采用流式细胞仪对表面印迹纳米粒对H. pylori的体外粘附效果进行了初步定量评价。各种方法得出的结果皆表明，表面印迹纳米粒对模板分子有更强的亲和力。纳米粒与H. pylori的体外初步粘附实验表明，此种纳米粒能通过识别H. pylori上的靶位点（Lpp20），实现对H. pylori的特异性粘附。