大豆灰斑病7号生理小种抗性基因精细定位与候选基因克隆

Molecular marker-assisted selection can increase significantly the efficiency of resistance breeding to Cercospora sojina in soybean. Fine mapping and cloning of resistance genes are the prerequisite and basis of molecular marker-assisted selection strategy for soybean resistance. In China, preliminary mapping of resistance genes against Cercospora sojina in soybean have been carried out. However, there are no related reports on fine mapping and cloning for them so far. In this study, based on the preliminary mapping of resistance gene Hrcs7 against Cercospora sojina race 7, a dominant pathogenic race in main soybean production regions, F2 segregating population from highly susceptible line and its near-isogenic line with resistance gene Hrcs7 will be used to genetic mapping. Following the genetic mapping with high-density SSR markers, the fining mapping will be accomplished with SNP and InDel markers developed by resequencing the near-isogenic lines and PCR amplification and sequencing of resistance genes in Hrcs7 region. Resistance genes will be screened by the bioinformatics analysis. The candidate genes of Hrcs7 will be identified by real-time quantitative RT-PCR. At last, they will be cloned. These researches will provide precise molecular markers for selection of the resistance genotypes against Cercospora sojina race 7 in soybean. The identification and cloning of the candidate resistance genes will also provide the basis for ascertaining the resistance genes.

分子标记辅助选择能够显著提高大豆灰斑病抗性育种效率，而精细定位和克隆抗病基因是进行分子标记辅助灰斑病抗性选择的前提和基础。我国大豆灰斑病抗性基因的初步定位研究已开展，但其精细定位与克隆研究尚无相关报道。本研究针对大豆灰斑病7号优势生理小种，在其抗病基因Hrcs7初步定位研究基础上，以一对近等基因系构建的F2代群体为作图群体，在高密度的SSR标记进一步定位后，通过全基因组重测序和定位区段内抗病基因PCR扩增与测序，开发SNP和InDel标记，精细定位抗病基因Hrcs7。利用生物信息学手段分析和筛选抗病基因，通过实时定量RT-PCR鉴定Hrcs7候选基因, 最终克隆Hrcs7候选基因。上述研究将为大豆灰斑病7号优势生理小种抗病基因型的选择提供准确的分子标记；同时，Hrcs7候选基因的鉴定和克隆，也将为抗性基因Hrcs7的最终鉴定奠定基础。

抗病标记对抗性的鉴定是通过基因型的鉴定，鉴定准确，不需要复杂的人工接种，不受气候条件影响和植物生长发育时期的限制。可见，大豆灰斑病抗病标记辅助选择能够显著提高大豆灰斑病抗性育种效率。精细定位和克隆抗病基因是进行分子标记辅助灰斑病抗性选择的前提和基础，我国大豆灰斑病抗性基因的初步定位研究已开展，但其精细定位与克隆研究尚无相关报道。本研究针对大豆灰斑病7号优势强毒性生理小种，在其抗病基因Hrcs7初步定位研究基础上，进行了简化基因组测序的BSA进一步定位；基于简化基因组测序结果和52K SNP芯片，开发CASP SNP 标记，对近等基因系F2群体进行精细定位，将Hrcs7基因定位在2号染色体59.92kb 区间内；并基于精细定位紧密连锁的标记，根据CASP SNP PCR的扩增效率和标记鉴定抗性的准确率，开发了2个鉴定效率达93%以上的CASP SNP 抗病标记。同时，在Hrcs7基因精细定位基础上，通过生物信息学预测和基因实时定量表达分析，发现Glyma.02g284100在抗病系和感病系间，在诱导表达丰度和高丰度表达的持续时间上存在明显差异，这两个基因可能是抗性基因。候选基因Glyma.02g284100在候选基因启动子序列差异显著，引起了控制元件的变化；而Glyma.02g284100在基因序列上未发现引起基因表达差异的突变。候选基因通过Hrcs7基因精细定位，本研究获得两个成果，一是开发了2个CASP SNP抗性标记。利用这两个抗性标记可以直接进行抗性基因型鉴定，解决了大豆灰斑病人工接种鉴定操作的复杂和鉴定的准确性问题，提高大豆灰斑病抗性育种效率。二是鉴定并克隆了灰斑病7号生理小种候选基因，从基因的结构和表达上了解了候选抗病基因,为最终抗性基因的确定奠定了坚实的基础，也加快了了解大豆灰斑病抗性机制的步伐。