基于VEGF信号通路研究加味孔圣枕中丹对慢性脑缺血白质损伤的保护作用

o.Attaching importance to the protection of white matter and improving chronic cerebrovascular ischemia white matter lesions is the key to lower the incidence of VD. VEGF has a function of inhibiting neuronal apoptosis by regulating PI3K/AKt pathway in addition to intervening the proliferation and differentiation of oligodendrocyte precursor cells（OPCs）. Earlier studies have proved that Jiawei Kongsheng Zhenzhong Pill can improve the learning and memory ability of VD, protect cerebral cortex and hippocampus neurons, strengthen the mRNA expression of cerebrovascular ischemia vascular endothelial growth factor（VEGF）and VEGFR. This study proposes " the scientific basis of Kongsheng Zhenzhong Pill's strengthening kidney and generating marrow, improving the chronic cerebrovascular ischemia white matter injury and lowering the incidence of VD lies in regulating VEGF signal pathway, inhibiting the apoptosis of OPCs, promoting the proliferation and differentiation of OPCs". This study will establish chronic cerebrovascular ischemia mice model and OPCs anoxia and glucose-derived injury model, apply the methods of neuroethology, Q-RT-PCR, Western-blot and flow cytometry, etc comprehensively, observe Jiawei Kongsheng Zhenzhong Pill's improving the cognitive dysfunction caused by chronic cerebrovascular ischemia white matter injury on the basis of VEGF signal pathway, study its function on the colloid cells apoptosis and OPCs proliferation and differentiation mediated by VEGF signal pathway from cellular and molecular levels in vitro and in vivo, reveal the biological basis of its function of strengthening kidney and generating marrow. In short, this study will broaden the scope of TCM's early intervention to lower the incidence of VD under the guidance of prevention theory.

改善慢性脑缺血白质损伤是降低VD发病率的关键。VEGF通过调控PI3K/AKt通路抑制脑细胞凋亡，促进OPCs增殖、分化。前期研究表明，加味孔圣枕中丹可改善痴呆学习记忆能力，保护皮层及海马神经元，增强缺血脑组织VEGF及其受体 mRNA表达。提出"调控VEGF信号通路，抑制少突胶质细胞及其前体细胞凋亡，促进OPCs增殖、分化是加味孔圣枕中丹发挥补肾生髓作用，改善慢性脑缺血白质损伤的科学基础"。建立慢性脑缺血大鼠模型和OPCs低糖缺氧损伤模型，综合运用神经行为学、Q-RT-PCR、Western-blot、流式细胞术等方法，基于VEGF信号通路，观察加味孔圣枕中丹对慢性脑缺血白质损伤的改善作用，从体内外角度、整体与分子水平，研究对VEGF信号通路介导的胶质细胞凋亡、增殖和分化干预作用，揭示补肾生髓作用的生物学基础。开拓中医"治未病"理论指导下中医药早期干预，降低VD发病率研究的新思路。

建立慢性脑缺血大鼠模型和OPCs低糖缺氧损伤模型，观察加味孔圣枕中丹对慢性脑缺血白质损伤的保护作用，探讨本方改善学习记忆能力的作用机制。.研究分为三部分。.第一部分 慢性脑缺血对大鼠学习记忆能力及脑白质损伤的影响：采用2-VO法建立慢性脑缺血大鼠模型，进行学习记忆能力评价及组织病理学观察，初步研究慢性脑缺血损伤后实验动物认知功能及脑白质损伤的变化，为后续研究奠定基础。结果显示2-VO法建立慢性脑缺血大鼠模型，慢性低灌注损伤21d时可出现明显的学习记忆功能障碍和脑白质损伤改变，随缺血时间延长呈进行性发展。.第二部分 加味孔圣枕中丹对慢性脑缺血大鼠脑白质损伤的保护作用：建立慢性脑缺血大鼠模型，应用神经行为学、免疫组化、免疫荧光等方法，观察加味孔圣枕中丹对慢性脑缺血大鼠白质损伤的保护作用，探讨本方改善学习记忆能力的作用机制。结果显示加味孔圣枕中丹能明显改善慢性脑缺血模型大鼠学习记忆能力，减轻慢性脑缺血脑白质病理损伤，抑制缺血缺氧引起的白质区脑细胞凋亡，促进OPCs增殖、分化，减轻髓鞘损伤，这可能是其改善慢性脑缺血白质损伤的作用机制。.第三部分 加味孔圣枕中丹对OPCs低糖缺氧损伤模型的干预作用：制备加味孔圣枕中丹含药血清，建立OPCs低糖缺氧损伤模型。应用流式细胞术、细胞免疫荧光法、实时荧光定量PCR法、WB等方法，观察加味孔圣枕中丹含药血清对OPCs低糖缺氧损伤模型的改善作用，探讨加味孔圣枕中丹对VEGF信号通路介导的少突胶质细胞凋亡和OPCs增殖、分化的干预作用。结果显示加味孔圣枕中丹含药血清能够显著改善OPCs低糖缺氧损伤，调控VEGF/VEGFR信号通路，抑制低糖缺氧引起的OPCs细胞凋亡，促进OPCs 增殖、分化，这可能是其改善OPCs低糖缺氧损伤，改善脑白质损伤的分子机制之一。