CBLα/β-CIPKβ-MTP8/11信号途径参与拟南芥响应高锰胁迫的分子机制

Manganese (Mn) is an essential micronutrient for growth and development in plants. However, manganese toxicity caused by acid soil seriously adversely affect crop yield. At present, acidic soil accounts for approximately 30% of the global soil. Therefore, it is of great significance to explore the molecular mechanism of plant response to manganese toxicity. Calcium sensor CBL-CIPK complex is involved in a variety of life processes in plants. However, whether the complex involved in response to manganese toxicity remain obscure. Our previous results demonstrated that the double mutant of Arabidopsis tonoplast-localized CBLα and its homologous protein CBLβ exhibited a high-Mn stress tolerance phenotype and reduced Mn content compared with wild-type (WT). CIPKβ can interact with CBLα or CBLβ, and the cipkβ mutant also exhibited tolerant phenotype to Mn toxicity compared with WT. Furthermore, the multiple of protein interaction analyses indicated that CIPKβ interacted with the manganese transporters MTP8 and MTP11. Based on these findings, whether CIPKs phosphorylate MTP8 and MTP11 will be analyzed in this project, and the phosphorylation sites of the substrates will also be identified. And then the effects of CBLα/β-CIPKβ on the activities of Mn transports MTP8 and MTP11 will be determined through the yeast transport assay for manganese. The project aims at unveiling the molecular mechanism of the CBLα/β-CIPKβ complex in regulating the manganese utilization and transport in plants, in order to lay a theoretical foundation for crop breeding improvement.

锰是植物生长发育所必需的微量元素，但酸性土壤造成的锰毒害会严重影响作物产量。目前酸性土壤约占全球土壤面积的30%。因此，研究植物应答锰毒害的分子机制具有重要意义。钙离子感受器CBL-CIPK复合体参与植物多种生命过程，但其是否调控植物对锰毒害的响应尚不清楚。申请人前期研究表明，拟南芥定位于液泡膜的CBLα/β基因的双突变体表现为高锰胁迫耐受表型，而且锰含量显著低与野生型植株。与CBLα/β互作的CIPKβ基因的突变体也表现为高锰胁迫耐受表型。多种蛋白互作分析结果表明CIPKβ与锰转运体MTP8和MTP11互作。本项目拟在此基础上，研究CBLα/β-CIPKβ能否磷酸化MTP8和MTP11并鉴定其磷酸化位点，再通过酵母锰离子转运活性分析等实验研究CBLα/β-CIPKβ对锰转运体MTP8和MTP11活性的影响。从而解析CBLα/β-CIPKβ调控锰转运的分子机制，以期为作物育种奠定理论基础。

锰是植物生长发育的必需微量元素之一，而植物吸收过量的锰，会造成锰毒害，危害植物正常的生长发育，造成减产减收。目前，锰毒害已经成为限制作物产量和品质的关键作用因子之一。因此，深入探讨植物吸收、转运和分配锰的分子机制具有重要的意义。Ca2+是植物重要第二信使。类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBL作为Ca2+感受器，能够与蛋白激酶CIPK形成复杂的调控网络，通过磷酸化修饰下游底物的方式解码和传递Ca2+信号。然而，Ca2+信号是如何产生、感知、解码和传递环境中锰浓度变化的研究仍十分薄弱，其分子机制有待进一步探索。.本项目基于GCaMP6f系统，发现高锰胁迫引起胞质Ca2+浓度升高，激发拟南芥体内Ca2+信号。采用反向遗传学手段筛选发现cbl2/3双突变体以及与CBL2/3互做的cipk3/9/26三突变体对高锰胁迫明显耐受，表现为主根伸长较长，鲜重显著增加。进一步研究发现，cbl2/3和cipk3/9/26突变体在高锰胁迫条件下根部锰含量明显升高而地上部锰含量显著降低。遗传学分析发现，CBL2/3位于MTP8的上游。利用BiFC、LCI、Pull-down和Co-IP四种互作手段，发现CIPK3/9/26与MTP8之间存在蛋白互作。体外磷酸化实验表明，CIPK3/9/26磷酸化修饰MTP8的第35位丝氨酸。进一步通过酵母转运活性、液泡锰含量测定以及高锰胁迫表型分析等实验，发现CIPK3/9/26介导的MTP8Ser35磷酸化抑制MTP8的转运活性进而参与调控拟南芥锰稳态。利用体内磷酸化、液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 分析等实验，发现CPKs和CIPKs对MTP8的磷酸化修饰存在时间上的明显差异。CPK4/5/6/11调控高锰胁迫早期的响应，将过量的锰离子隔离到液泡中，以缓解锰离子的毒害作用。而在高锰胁迫的后期，植物为了实现生长和逆境的最佳平衡，CBL2/3招募CIPK3/9/26到液泡膜上并磷酸化修饰MTP8，降低MTP8活性以起到“刹车”的作用。.综上所述，本论文发现了高锰胁迫激发植物体内Ca2+信号，系统阐明了CIPK3/9/26和CPK4/5/6/11差异磷酸化修饰MTP8从而精细调控植物锰稳态的生物学过程和分子机制。研究成果为解决作物在酸性土壤锰毒害问题提供了全新的视角和分子靶标，为利用MTP蛋白家族精准创建有益重金属的超富集作物和有毒重金属的低积累新品种奠定