降脂天然产物GBN异构体的制备及生物活性比较研究

胡椒基戊二烯异丁酰胺（GBN）是国家自然科学基金资助下，本课题组从降血脂蒙药荜茇中发现的具有显著降脂活性的天然化合物，获得了国家发明专利。近年来，将其作为降脂候选药，在化学合成、药理毒理、质量控制方面做了系统的研究。发现GBN溶液在光照下会产生另外3种顺反异构体，而其异构体是否对其生物活性及毒性产生影响，目前国内外尚未见报道，而此问题对研发化学药是非常有必要阐明的。本项目为揭示GBN异构体生物活性间可能的差异，采用高效液相色谱、液质联用等仪器分析在不同光源诱导下异构体产生的动态变化，确定最佳光照条件，诱导产生异构体，采用半制备型高效液相色谱分离、制备所有异构体化合物，通过核磁共振、质谱、紫外、红外光谱等确定其分子结构，分析理化性质；采用动物实验和体外活性实验比较研究各异构体降脂作用、毒性和对特定受体基因表达的影响。探索其构效关系，为降血脂化学创新药GBN的成药性评价，提供有价值的科学依据。

我们课题组多年来对降血脂蒙药--荜茇进行了深入研究，首次发现了天然化合物荜茇宁（代号GBN）有显著的降血脂活性，且毒性极低。此研究入选国家重大新药创制专项的候选药课题。药物的异构体对其毒性和活性的影响，是药物研发中必须解决的重要的问题，本项目研究目的是为降血脂创新药GBN提供该化合物异构体方面的实验依据。. 研究发现荜茇宁溶液对光极不稳定，在 4500Lux的光照箱中照射15分钟后主成分峰被降解，产生另外3种降解物，经LC-MS分析，证实与GBN共属同分异构体。采用半制备高效液相色谱，分离得到了GBN 及其另外2种异构体的化合物。采用UV、MS、NMR等，确证了结构分别为N-异丁基-5-(3,4-亚甲双氧苯基)-2E,4E-戊二烯酰胺（白色晶体）；N-异丁基-5-(3,4-亚甲双氧苯基)-2Z,4E-戊二烯酰胺（白色晶体）；N-异丁基-5-(3,4-亚甲双氧苯基)-2E,4Z-戊二烯酰胺（白色晶体）。. 为研究GBN异构体对生物活性是否有影响，用光照诱导产生50%异构体的混合物与GBN对比进行了降血脂药效实验，采用大鼠高脂血症（HLP）模型，研究异构体对降血脂活性的影响，结果表明异构体高剂量组和低剂量组均可显著降低HLP大鼠血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG），并呈剂量依赖性，与GBN的活性没有显著差异。用MTT法通过HepG2细胞对GBN 3种异构体进行了细胞毒性的比较，以辛伐他汀和胡椒碱做为阳性对照，3种异构体对HepG2细胞的毒性都很低，均显著低于辛伐他汀和胡椒碱。GBN-P1，GBN-P2 和GBN-P3的LC50分别是0.407mM，0.587mM，0.360。体外考察了GBN-P1，GBN-P2 和GBN-P3对HepG2细胞脂质代谢相关蛋白，低密度脂蛋白受体（LDLR）基因表达的影响用10μM浓度的GBN-P1, GBN-P2, GBN-P3以及阳性对照药辛伐他汀处理HepG2细胞，以配药溶剂处理细胞作为空白对照。三种异构体均能不同程度上调HepG2细胞LDLR基因的表达，相互间无显著差异。. 本研究首次分离得到了GBN的另外2种异构体，并通过动物实验和细胞实验进行体内、体外毒性和活性的比较，明确了GBN顺反异构体之间毒性及降血脂活性没有显著差异，为GBN的成药性评价提供有价值的理论依据和实验数据。亦将为地区民族医药的发展做出贡献。