利用碳水化合物结合模块研究纤维素表面异质性及对水解速率的影响

Cellulose is the most abundant biomass on earth. The efficient use of cellulose is important for bioenergy, biomaterial production, and sustainable development of society. Enzymatic hydrolysis of cellulose by cellulase is a typical heterogeneous reaction at a solid/liquid interface, so adsorption of cellulase on cellulose is prerequisite for efficient hydrolysis. Kinetic analysis and hydrolysis experiment of cellulose degradation have showed that cellulose accessibility to cellulase is an important factor to hydrolysis efficiency. Some 'stuck' enzymes which show inactive causes rate retardation. It is assumed that the cellulose surface heterogeneity affect the adsorption and hydrolysis rate of cellulase. Our previous research showed that carbohydrate binding modules (CBM) can recognize fine substructures of cellulose, and can be used to quantitatively determine the crystalline or amorphous cellulose accessibility. In this research, fusion protein which contain a fluorescent protein and a substrate specific CBM will be constructed to study the dynamic change of surface heterogeneity during hydrolysis of cellulose. We hope to reveal the relationship of cellulose surface morphology and enzyme-substrate interaction during the process of cellulose hydrolysis by cellulase. A strategy for improving the activity of cellulase will be conducted; the development of cellulose-based bioenergy will be promoted.

纤维素生物降解的难题在于酶解效率低。纤维素酶水解是发生在固相表面的双相反应体系，液相酶结合在固相纤维素表面是反应发生的先决条件，因此纤维素表面能够结合纤维素酶的部分，纤维素可及度，是影响纤维素水解效率的重要因素。研究发现未知因素导致纤维素酶停滞在纤维素表面，形成无活性结合状态，不仅自身不催化反应，还影响其他酶的结合与水解，导致酶解效率下降。猜测纤维素酶的停滞与纤维素表面结构有关。本课题拟研究纤维素表面结构对纤维素酶水解效率的影响。纤维素表面具有异质性特点，纤维素酶与纤维素的结合通过碳水化合物结合模块CBM实现对晶型或无定型结构的识别。构建特异性CBM-荧光融合蛋白，定量研究纤维素水解过程中不同纤维素结构可及度的变化，研究纤维素结构对纤维素酶-纤维素底物相互作用的影响，阐明纤维素酶水解过程中酶的动态结合与纤维素表面结构的关系，指导高效纤维素酶的筛选与改造，促进纤维素生物能源的开发与利用。

纤维素生物降解的难题在于酶解效率低。纤维素酶水解是发生在固相表面的双相反应体系，液相酶结合在固相纤维素表面是反应发生的先决条件，因此纤维素表面能够结合纤维素酶的部分，纤维素可及度，是影响纤维素水解效率的重要因素。本研究构建了结合不同纤维素表面的碳水化合物结合模块CBM2、CBM3、CBM10，CBM17、CBM30、CBM44与荧光蛋白GFP、CFP的荧光融合蛋白CC2、CC3、CC17、CC10、GC3、GC17、GC30和GC44表达载体，成功实现蛋白的高表达和纯化，将其应用于纤维素表面可及度的分析，并研究了微晶纤维素水解过程中不同纤维素结构可及度的变化，发现球磨工艺能显著提高CBM2、CBM3以及CBM30类型的表面可及度，而CBM44类型的表面可及度变化不大。该结果为阐明纤维素酶水解过程中酶的动态结合与纤维素表面结构的关系，指导高效纤维素酶的筛选与改造，促进纤维素生物能源的开发与利用有指导意义。