基于DNA催化自组装的模块化荧光生物传感技术及其生物医学应用研究

In this proposal, we intend to introduce dynamic DNA nanotechnology and fluorimetric technique as the basis and toehold-mediated strand displacement as a key reaction to focus on the following scientific problems, aiming to realize sensitive and specific detection of tumor markers and combined detection of tumor marker levels. Firstly, analyte-induced DNA conformational change, the mechanism of enzyme action, and allele-specific ligation or extension will be used to design and construct molecule recognization modules which will be utilized to dock with the three-way junction modules. Secondly, three-way junction modules will be designed and assembled on the basis of the associative toehold activation, which derive from the real-time, synchronous, and determined molecule specific recognization. The introduction of associative toehold activation will enhance the universality of the research method and reduce the background leakage originating from the misfolding of catalytic DNA. Thirdly, the mismatch mechanism will be recommended to optimize the design of the hairpin substrates, decrease the background signal owing to uncatalyzed strand displacement reactions and dynamically assemble efficient linear and exponential amplified fluorescent signal modules. Finally, the architecture of detection will be integrated via modular components, which can realize sensitive and specific detection of tumor markers and combined detection of tumor marker levels in plug-and-play mode. The proposed research is expected to provide powerful technical support for the early screening, accurate diagnosis, and effective treatment of cancers in clinical environment.

本项目拟以实现肿瘤标志物的灵敏特异性检测和多种肿瘤标志物联合检测为目标，以动态DNA纳米技术和荧光分析技术为研究平台，以Toehold介导的链置换反应为核心反应，重点解决以下关键科学问题：（1）利用目标物诱导DNA构象转变、酶催化作用、变异基因的连接或聚合等特异性反应设计构建分子识别模块，并解决与DNA三向节模块的对接问题；（2）利用Toehold的"结合活化策略"设计组装能实时、同步、定量转换目标分子特异性识别事件的DNA三向节模块，在提高方法通用性的同时，解决触发链二级结构多样性带来的背景泄漏问题；（3）利用"碱基错配"机制优化发卡的设计，解决发卡泄露造成的背景干扰问题，构建高效的单循环和指数动态DNA催化自组装荧光信号放大模块；（4）以即插即用的方式构建超灵敏、特异性、模块化的肿瘤标志物检测系统和多种肿瘤标志物的联合检测系统。以期为癌症早期筛查、准确诊断和有效治疗提供有力的技术支持。

本项目以基于DNA模块化组装的动态DNA纳米技术为研究平台，以粘性末端介导的链置换反应为核心反应，构建了若干生物传感技术，用于肿瘤标志物的灵敏特异性检测和多种肿瘤标志物的联合检测。工作主要包括：（1）提出了基于DNA三向节的粘性末端活化策略用于DNA模块化自组装，将两种目标核酸酶的作用转导为通用的触发模块，以“即插即用”方式连接DNA放大模块，该方法对UDG酶和CpG甲基转移酶的检测限分别达0.000043 U/mL和0.019 U/mL。（2）发展了基于结合诱导的缝合粘性末端活化策略，用于构建DNA触发模块；该触发模块的反应速率可控，且可通过调整适体和链迁移区域序列，实现多种环境刺激物响应下的触发。（3）利用作用模型指导界面上探针的模块化组装，应用于目标物的灵敏检测，探针在模型导向下被合理地组装于界面区域，以有效地结合目标物，该方法可检出低至10个HeLa细胞中提取的端粒酶。（4）发展了DNA信号放大技术用于灵敏检测肿瘤标志物，包括基于免标记无酶DNA机器的荧光放大方法用于灵敏检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性、基于链置换扩增和DNAzyme扩增的荧光双扩增策略用于灵敏检测DNA甲基转移酶活性、基于粘性末端介导的链置换反应的荧光信号扩增方法用于尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的灵敏检测、单个集成化的磁性微探针用于单细胞水平的人类甲基转移酶活性的灵敏准确分析等。（5）开展了DNA在生物分子作用下变构与检测应用研究，包括构建灵巧的DNA镊子用于检测端粒酶活性、基于分裂式识别模式结合级联信号放大策略用于microRNA的高特异和灵敏检测、共区域化识别激活的级联信号放大用于转录因子的高灵敏检测、基于氧化石墨烯荧光开关的多功能G四倍体发夹探针用于转录因子的免标记、灵敏检测等。本项目所取得的研究成果有望为肿瘤早期筛查、准确诊断和有效治疗提供新的分析方法和技术支持。