尿毒症毒素降低hERG通道功能介导慢性肾衰竭心律失常发生的机制研究

Life-threatening ventricular arrhythmias and sudden cardiac death (SCD) are the leading causes of death in chronic renal failure (CRF) patients. Presently, the mechanisms underlying CRF-related SCD are not fully understood, and the effective preventive measures are lacking. QT interval prolongation, observed on the electrocardiogram (ECG), is common in CRF patients. Dysfunction of the cardiac potassium channel, hERG, delays cardiac repolarization and causes QT interval prolongation, representing one of the most fundamental mechanisms of SCD. Thus, we hypothesize that uremic toxins cause hERG channel dysfunction through enhanced degradation of hERG protein or via direct blockade of hERG current, leading to QT prolongation with an increased risk of ventricular tachycardia and SCD. We will use hERG-HEK cells and a rabbit CRF model, together with molecular and biological methods (ELISA, flow cytometry, real-time PCR, Western blot, patch clamp, and surface ECG recordings), to investigate the effects of CRF on hERG channels and the corresponding molecular mechanisms. These results will extend our understanding of the mechanisms of CRF-related ventricular arrhythmias and SCD, and will lay a foundation for the development of novel therapeutic strategies.

室性心律失常、心源性猝死是慢性肾衰竭（CRF）患者的主要死因之一，但其确切机制尚不清楚。QT间期延长是CRF患者常见心电图表现，而心脏hERG通道功能降低是引起心脏复极延迟、QT间期延长的关键因素，也是发生心源性猝死的重要分子机制。我们前期发现CRF患者血清可以降低hERG通道表达。因此，我们假设尿毒症毒素通过降低hERG通道表达或直接抑制hERG通道电流，导致心脏复极延迟，QT间期延长，从而介导CRF患者室性心律失常、心源性猝死的发生。本研究拟分别利用稳定表达hERG的HEK细胞和慢性肾衰竭兔模型，采用定量PCR、Western blot、ELISA、流式细胞仪、心电图及膜片钳等方法，阐明CRF尿毒症毒素引起hERG通道表达和功能降低的原因、关键环节及其介导CRF患者心律失常发作的分子机制。预期结果对于理解CRF发生心律失常的病理生理机制，寻找更加有效的预防措施具有重要的理论和实际意义。

背景：室性心律失常、心源性猝死（SCD）是慢性肾衰竭（CRF）患者的主要死因之一，尽管其确切机制尚不清楚，但是很多患者表现有心电图QT间期延长。hERG基因编码的心脏hERG通道（介导快速延迟整流钾电流IKr）对于心脏复极至关重要。hERG电流/IKr降低导致长QT综合征，产生致死性心律失常。CRF患者血液中持续堆积的尿毒症毒素被证实可以影响多种生物功能。CRF患者血清p-Cresol浓度显著增高，其与心电图QT间期延长有关，但是其中因果关系并未得到证实。而hERG通道功能降低是长QT综合征的常见原因，因此本项目主要探讨了p-Cresol对hERG通道表达及功能的影响及其分子机制。.方法：记录健康对照和慢性肾衰竭患者血液透析前后的体表心电图，采用高效液相色谱测定健康对照和慢性肾衰竭患者血液透析前后血清尿毒症毒素水平，采用Western blot检测hERG通道蛋白表达，采用免疫荧光染色检测细胞膜上hERG通道的定位，采用全细胞膜片钳记录电流。 .结果：发现尿毒症患者透析前后心电图QT间期均延长，而尿毒症患者透析前后血清均能降低hERG通道表达及电流。进一步发现慢性肾衰竭患者透析前后血清p-Cresol浓度均增加。p-Cresol急性作用不能降低hERG电流，但是慢性作用显著降低hERG电流。其机制主要是p-Cresol不影响hERG通道的mRNA表达，但通过泛素连接酶Nedd4-2介导的泛素化降解而剂量依赖性降低细胞膜上hERG通道蛋白的表达。破坏hERG通道上泛素连接酶Nedd4-2的结合位点（hERG-△1073突变）后彻底消除p-Cresol对hERG通道表达和功能的降低作用。此外，p-Cresol还增加细胞内Ca2+浓度，细胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM能削弱p-Cresol对hERG通道表达和功能的降低作用。进一步发现p-Cresol同样延长乳鼠心肌细胞动作电位时程（APD），降低IKr，但不改变INa和IBa。在体内动物实验也证实p-Cresol注射可以延长家兔心电图QT间期，降低心肌细胞ERG的表达。.结论：我们的结果表明尿毒症毒素p-Cresol在CRF患者恶性心律失常或SCD发作中起着重要作用。这些结果不但促进了我们对CRF相关心律失常发生机制的理解，同时也为CRF患者心律失常及SCD的发作提供了新的治疗靶点。.