法尼醇X受体介导的NLRP3炎症小体组装抑制途径在黄芪甲苷保护顺铂急性肾损伤中的作用机制研究

Cisplatin-induced acute kidney injury (AKI) is an important limit reason on clinical treatment of cisplatin, and the inflammatory response is one of the underlying mechanisms. Activation of nod-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome has been consideried as a key mechanism in releasing of inflammatory cytokines. Up to now, the latest research demostrated that farnesoid X receptor (FXR) was found to be an important negative regulator of NLRP3 inflammasome assemble in liver and up-regulation of FXR could inhibit inflammatory response. According to the pre-experiments in vivo and vitro, applicant firstly found that activation of NLRP3 and inhibition of FXR was accosiated with cisplatin-induced AKI, and Astragaloside IV (AS IV) could reverse the expression of NLRP3 and FXR to protect cisplatin-induced AKI. Based on it, we proposed the hypothesis that AS IV could inhibit the release of inflammatory cytokines and protect cisplatin-induced AKI through FXR mediated NLRP3 inflammasome assemble pathway. To test the hypothesis, we would indroduce Fxr-/-mice in vivo and HK-2 cells with siRNA inhibited FXR in vitro, and use the methods of ELISA, HE staining, immunofluorescence, flow cytometry, Western Blot and PCR in the experiments.

顺铂引起的急性肾损伤是影响其临床疗效的重要原因，而炎症反应是其关键的损伤机制之一。Nod样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体的组装可以引起炎症因子释放，已成为探究炎症反应发生机制的新热点。最新研究表明肝脏中上调法尼醇X受体（FXR）的表达可在上游抑制NLRP3炎症小体的组装，从而抑制炎症反应的发生。申请人通过动物和细胞水平的预实验发现顺铂引起的肾损伤伴随着NLRP3的激活，该发现尚未见相关报道，而给予黄芪甲苷后可以通过上调FXR的表达逆转这种现象，减轻顺铂的肾毒性。基于此我们提出本课题的假说：黄芪甲苷可能经肾脏中的FXR介导NLRP3炎症小体组装抑制途径，抑制炎症反应，保护顺铂引起的急性肾损伤。申请人拟构建Fxr-/-基因敲除小鼠和siRNA构建FXR低表达的HK-2细胞，利用ELISA、HE染色、免疫荧光、流式细胞术、Western Blot及PCR技术，最终在动物和细胞水平验证该假说。

黄芪甲苷是我国传统道地药材黄芪中的主要活性成分，申请人通过本课题的开展，探究了黄芪甲苷保护顺铂肾损伤的作用机制，同时亦对其增加顺铂抗肿瘤活性机制进行了考察，最终证明了黄芪甲苷对顺铂具有减毒增效的双重作用。申请人首先分别在动物水平和细胞水平考察了法尼醇X受体（FXR）-NLRP3炎症小体途径在黄芪甲苷保护顺铂肾毒性中的作用。顺铂注射液以每两天4mg/kg的剂量腹腔注射7次，黄芪甲苷则以75mg/kg的剂量口服14天，根据血肌酐和尿素氮，以及HE染色结果表明黄芪甲苷能够保护顺铂的肾损伤。采用Western blotting和免疫组化等方法，通过相关研究明确了黄芪甲苷可以上调FXR的表达，并抑制NLRP3炎症小体的活性，炎症小体的组装物即Caspase 1和ASC的表达同样下降，最终抑制炎症反应的发生。申请人同时利用FXR的选择性抑制剂没药甾酮验证了该机制的重要作用。在细胞水平，申请人利用肾小管上皮细胞HK2也开展了相关研究，表明黄芪甲苷同样能够激活FXR的表达，同时抑制NLRP3，保护了顺铂诱导的细胞凋亡。此外，申请人亦利用代谢组学手段，从系统生物学的角度整体分析了黄芪甲苷保护顺铂肾毒性的作用机制。采用HPLC-TOF/MS的方法对大鼠肾脏和血液急性代谢组学分析，最终表明，黄芪甲苷可通过调控炎症反应、氧化应激损伤和能量代谢等，从而保护顺铂诱导的肾损伤。申请人对尿液中的顺铂肾损伤生物标志物同样进行了筛选，最后筛选出4个敏感的代谢物作为候选生物标志物。最后，申请人尚考察了黄芪甲苷对顺铂抗肿瘤作用的影响。采用小鼠肺癌细胞Lewis肿瘤细胞荷瘤小鼠，在动物水平同时给与顺铂腹腔注射及黄芪甲苷灌胃，发现其抗肿瘤作用比单独使用顺铂时明显增强，且其可能与抑制肿瘤外排型转运体有关。综上，本课题发现黄芪甲苷联合顺铂具有减毒增效的双重作用，有进一步开发的巨大潜力。