MEG3调控TGF-β/Smad通路参与甲状腺相关眼病眼外肌纤维化的效应及机制研究

The pathogenesis of extraocular muscle fibrosis of thyroid-associated ophthalmopathy (TAO) which lacks effective treatment is not yet clear. We found the low expression of long chain non-coding RNA (lncRNA) MEG3 through high-throughput sequencing and Q-PCR in TAO extraocular muscle samples and cultured fibroblasts. The proliferation rate of TAO fibroblast stimulated by TGF-β1 was significantly higher than that of normal control. Enforced expression of MEG3 in TAO fibroblasts inhibited TGF-β1-induced cell proliferation and the expression of phosphorylated Smad3. It was reported that TGF-β/Smad pathway is the key of TAO extraocular muscle fibrosis. Therefore, we speculated that MEG3 was involved in the fibroblast proliferation and fibrosis of TAO extraocular muscle through TGF-β/Smad pathway. This project aims to investigate the effect of MEG3 on fibroblast proliferation, phenotype transformation and then the fibrosis of extraocular muscles in expanded clinical samples, cultured fibroblast cells and animal models, to explore the regulatory mechanism of MEG3 on TGF-β/Smad signaling pathway. Those results could provide new insight into the therapy of TAO.

甲状腺相关眼病（thyroid-associated ophthalmopathy，TAO）眼外肌纤维化的机制尚不完全清楚，且缺乏有效治疗措施。我们通过高通量测序和Q-PCR发现TAO纤维化眼外肌和成纤维细胞中长链非编码RNA(lncRNA) MEG3低表达的现象；体外实验发现在相同浓度TGF-β刺激下，TAO成纤维细胞的增殖较正常对照加快，通过质粒构建稳定过表达MEG3的成纤维细胞的增殖受到抑制，且磷酸化Smad3蛋白的表达显著降低。已知TGF-β/Smad通路是TAO眼外肌纤维化的关键环节，因此我们推测MEG3调控TGF-β/Smad通路影响眼眶成纤维细胞增殖和眼外肌纤维化。本项目拟扩大临床样本，联合细胞实验和动物模型，研究和验证MEG3对成纤维细胞增殖、表型转化和眼外肌纤维化的作用，MEG3对眼眶成纤维细胞TGF-β/Smad通路的调控作用和机制，为TAO治疗提供新思路。

甲状腺相关眼病（thyroid-associated ophthalmopathy，TAO）是成人最常见的眼眶病，其中眼外肌纤维化是中晚期TAO一个重要的难以逆转的病理特征，机制尚不清，且缺乏有效治疗措施。本项目发现TAO眼外肌来源成纤维细胞MEG3低表达的现象，过表达MEG3能够抑制眼眶成细胞增殖和肌成纤维细胞表型的转化；TAO组眼眶成纤维细胞α-SMA，COL-I、MMP-2、TIMP-1、Smad mRNA的表达均高于正常组，过表达MEG3能够下调α-SMA，COL-I、MMP-2、TIMP-1、Smad mRNA的表达，反之干扰MEG3能够上调上述因子mRNA的表达，证实了MEG3通过Smad通路抑制TAO眼外肌纤维化的作用和机制。另外，TAO眼外肌lncRNA表达谱的检测和分析得到差异表达倍数大于2倍且P < 0.05的lncRNA1270条（上调655条，下调615条），mRNA条952条（上调304条，下调648条）。通过GO，KEGG和lncRNA-mRNA 的CNC 共表达网络以及Q-PCR验证表达以后，我们靶定了2条全新的目标lncRNA，免疫荧光结果显示这两条lncRNA均分布于细胞质中。功能研究证实过表达ENST00000581911能够显著上调眼眶成纤维细胞胶原蛋白和透明质酸的分泌，显著上调CTGF、MMP-9 mRNA表达，以及α-SMA、CTGF、MMP-9和TIMP-1蛋白的表达；反之，敲减ENST00000581911能够下调胶原蛋白和透明质酸的分泌，下调α-SMA、CTGF和MMP-9 mRNA表达，下调α-SMA、CTGF、MMP-9和TIMP-1蛋白的表达水平至正常或者低于正常对照；然而，过表达或者敲减lncRNA ENST00000424343对上述各个因子表达水平的影响并不显著。TAO眼外肌病变非常复杂，涉及早期的细胞外基质异常积聚、重塑和晚期的纤维化过程，综上所述，本研究发现MEG3和ENST00000581911分别参与了TAO眼外肌纤维化和细胞外基质重塑过程的现象与机制，该研究成果不仅丰富了TAO的发病机制理论，并且为精准防治TAO眼外肌不同阶段的病变提供了特异性的分子靶标和理论依据。