Fis对伤寒沙门菌罕见线性质粒复制影响的机制研究

H:z66阳性伤寒沙门菌含有一罕见的线性质粒，介导鞭毛单向相变换。已知细菌中存在与线性质粒末端结合的蛋白（末端蛋白），为质粒复制所必需。Fis为肠杆菌保守的调节蛋白，可影响细菌基因表达及DNA复制。我们最近发现，伤寒沙门菌fis基因缺失后该线性质粒发生了丢失，且fis缺陷株中与DNA复制直接相关的基因表达相对野生株无差异，推测Fis有可能通过调控其末端蛋白编码基因而影响该线性质粒的复制。本研究拟通过分离纯化该线性质粒的末端蛋白，用质谱进行鉴定，并确定其编码基因，应用qRT-PCR等技术观察该基因在fis缺陷株中的表达；通过凝胶阻滞试验观察Fis和末端蛋白编码基因启动区域的结合情况，再利用DNase I足迹技术揭示Fis所结合的启动区域具体部位，并回补fis基因进一步验证Fis对末端蛋白表达的调控作用。研究结果可在分子水平揭示Fis影响线性质粒复制的机制，加深人们对线性质粒生物学特性的认识。

H:z66阳性伤寒沙门菌含有一介导鞭毛单向相变换的线性质粒pBSSB1，其全长27kb，两端具有反向重复末端结构。为了探索线性质粒pBSSB1的复制分子机制，本研究以参与染色体和质粒DNA复制的调节蛋白Fis为切入点，成功提取了pBSSB1和末端蛋白Tp的复合物，制备了fis基因缺陷变异株，利用伤寒沙门菌全基因组DNA芯片筛选fis缺陷变异株与野生株的差异表达基因，在mRNA水平确定受Fis调控的基因；利用二维蛋白电泳筛选fis缺陷变异株与野生株菌体蛋白和分泌蛋白的表达差异，并通过质谱鉴定了在蛋白水平受Fis调控的基因；首次发现Fis蛋白为伤寒沙门菌线性质粒复制所必需的前提蛋白，同时可以影响细菌的动力。研究还发现线性质粒pBSSB1编码的6个特异性基因在细菌的不同生长时期均有表达，且表达量随着细菌的生长逐步增加，通过改变其表达应对在伤寒沙门菌感染过程中必须经历的酸、氧和高渗应激环境。研究还发现，线性质粒pBSSB1自身编码的第8和第17号基因可以通过调控细菌染色体基因和线性质粒本身的基因影响细菌的生长、动力以及线性质粒的复制。综上，本项目首次揭示了Fis参与线性质粒pBSSB1复制的作用机制，阐明了pBSSB1编码基因的表达时相特征以及第8和第17号质粒基因参与线性质粒本身复制的作用机制，为进一步全面深入地研究线性质粒pBSSB1的复制分子机制奠定了坚实的基础。