叶酸/同型半胱氨酸代谢相关基因调控神经干细胞增殖分化的分子机制研究

本研究将体外原代培养大鼠胚胎大脑皮质神经干细胞（NSCs）；通过RNAi技术对叶酸/同型半胱氨酸(Hcy)代谢循环链关键基因（MTHFR和CBS基因）进行消除或抑制；MTT法、BrdU掺入法、免疫组化双标记及激光扫描共聚焦显微镜检测叶酸及缺乏RNAi阻断两基因后NSC增殖分化情况；同时采用双向凝胶电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS），研究叶酸缺乏及RNAi干预对NSC增殖分化过程中蛋白质组图谱变化的影响，寻找组间差异蛋白质，Western blot反向验证。本研究将从细胞分子水平，深入探索叶酸/同型半胱氨酸代谢循环在NSC增殖分化的作用，并揭示遗传因素和营养因素对NSC增殖分化作用的异同点，为高Hcy对胚胎大脑的致畸作用及对成体神经系统损伤机制的研究奠定基础，并为神经发育异常及神经退行性疾病的预防和治疗提供新的思路。

摘要：近年来研究发现，叶酸缺乏和伴随其后的血中Hcy水平增高在神经系统发育中可影响神经可塑性，从而导致神经退行性病变。本研究成功构建了叶酸/同型半胱氨酸(Hcy)代谢循环链关键基因（MTHFR和CBS）特异性的shRNA真核表达载体。MTT法、免疫组化双标记及激光扫描共聚焦显微镜检测结果表明叶酸缺乏及RNAi阻断两基因可显著抑制体外培养的神经干细胞（NSC）增殖，并减少NSC向神经元方向分化。HPLC分析发现各干预组增殖期NSC中Hcy的浓度显著提高。同时采用双向凝胶电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS），研究各干预组在NSC增殖过程中蛋白质组图谱变化，共筛选到26个蛋白质差异点，经质谱鉴定其中2个蛋白与线粒体能量代谢有关。进一步鉴定结果表明叶酸缺乏和MTHFR/CBS RNAi降低了（顺）乌头酸水合酶和线粒体呼吸链bc1复合物亚单元2的基因表达水平，抑制了多个线粒体呼吸酶和SOD活性，降低了NSC ATP水平，促进了氧自由基的产生。另外，叶酸缺乏和MTHFR/CBS RNAi改变了分化期NSC与甲基循环途径相关的SAM和SAH含量，降低了Dnmts的活性，故推测线粒体的代谢与DNA甲基化水平均可能在叶酸缺乏及MTHFR/CBS RNAi抑制NSC增殖分化过程中扮演着重要角色。同时，营养因素（叶酸缺乏）和遗传因素（MTHFR/CBS基因表达的降低）抑制NSC增殖分化的分子机制具有许多共同之处，但对于机制中所涉及的线粒体代谢和DNA甲基化的之间关联性还需要进一步探讨。本研究为叶酸缺乏和高Hcy在中枢神经系统疾病发生发展中所起的负面作用提供科学依据，为神经发生异常和神经退行性疾病的预防和治疗提供新的思路。