基于人类胚胎干细胞的新型类器官肺癌模型

Lung cancer is the first leading cause of cancer death and the most commonly diagnosed cancer. Even worse, the overall 5-year survival rate is about 15%, and patients with lung cancer are of minimal chance to be cured. Over decades, mouse models of lung cancer have been widely used to investigate the mechanisms underlying tumor initiation and progression, as well as targeted therapies and drug resistance. However, these models show limited similarities with patients. The major reason accounting for the discrepancy is believed to be the inherent physiological differences between the two species. To overcome this limitation, we plan to establish novel cancer models based on human embryonic stem cells (hESCs) -derived organoids. We will create KRAS(G12D) knock-in and inducible TP53 and PTEN knock-out hESCs. These gene-edited hESCs will be differentiated into lung organoids in vitro, and the tumorigenesis potential of variant cell types in the organoids will be investigated. The lung organoids will be ectopically or orthotopically transplanted under kidney capsule or in the lung of immune-compromised NSG mice, and their tumorigenesis ability will be investigated in vivo. Since hESCs have two features, self-renewal and pluripotency, unlimited amount of lung organoids could be differentiated from gene-edited hESCs to make the organoid tumor model. The novel model will be a powerful system to study the molecular and cellular mechanisms underlying lung cancer initiation and progression, as well as be a platform to screen novel drugs to treat human lung cancer.

肺癌是最难治愈的癌症之一，也是目前死亡病例和发病病例最多的癌症，对人类健康造成严重威胁。虽然现有各种小鼠肺癌模型加强了我们对于肺癌的发生、发展和治疗的认识，但由于物种差异等原因，这些模型还不能全面有效模拟肺癌病人的病理特征及疾病进程。对此，我们拟构建癌基因KRAS(G12D)基因敲入及抑癌基因TP53和PTEN诱导性敲除的人类胚胎干细胞（hESCs）细胞株，体外分化hESCs为肺类器官（organoid）并传代，体外研究KRAS(G12D)、TP53和PTEN对肺类器官中不同类型细胞的成瘤作用，移植肺类器官细胞至免疫缺陷小鼠肾包膜下及肺部，体内研究其成瘤性。hESCs具有无限增殖能力，可提供足够肺类器官重复性建立此体外/体内新型自发性肺癌模型。此模型一旦构建成功，将成为研究肺癌发生发展机制以及寻找新疗法的一种重要工具。

肺癌是最难治愈的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率位居所有癌症前列，严重威胁人类健康。目前各种肿瘤细胞系和小鼠模型极大的增加了我们对于肺癌发生发展和诊疗方面的认知，但由于细胞系不能有效模拟体内天然环境以及人鼠物种差异等原因，这些模型还不能全面有效的模拟肺癌病理特征及疾病进程。在本项目中，我们开发新型CRISPR基因编辑工具，结合人类胚胎干细胞和类器官技术，成功建立基于人类胚胎干细胞的新型类器官肺癌模型，着重研究了哪些常见遗传损伤（基因突变）可以起始肿瘤发生，并初步探索其细胞机制和分子机制。我们成功构建癌基因KRAS(G12D)、EGFR（L858R）基因敲入及抑癌基因TP53和PTEN诱导性敲除的人类胚胎干细胞细胞株，体外分化得到上皮细胞和间质细胞均衡的肺类器官、以气道上皮细胞为主的气道类器官和以肺泡上皮为主的肺泡类器官。利用以上人源肺类器官模型，我们发现KRAS（G12D）突变肺类器官在体外（培养皿中）和体内（肾包膜下移植）表现出肿瘤病理特征，单细胞测序技术发现KRAS（G12D）二型肺泡细胞出现退分化现象，分子层面发现肿瘤相关通路激活和代谢紊乱等肿瘤早期特征。基因编辑技术是本项目的支撑技术，我们成功开发一系列基于CRISPR/Cas9系统的新技术，包括可实现外源DNA高效靶向整合的Cas9-N57系统、基于SynNotch受体和Cas9核酸酶的细胞相互作用触发的基因编辑技术、可包装入一个AAV病毒颗粒的miniCAFE基因激活系统、高效高保真的Cas12a-Plus系统、以及可全基因组范围评价CRISPR系统特异性的Tag-seq技术等。这些技术既可以应用于基础研究领域，包括肿瘤发生发展和细胞命运决定等相关的细胞和分子机制，也可以应用于转化研究领域，包括开发高效安全的CAR-T和其他治疗用的功能性治疗细胞等。因此，通过本项目的研究，我们优化了人胚胎干细胞分化为肺类器官的策略，发现KRAS(G12D)可以起始肺癌发生，并初步发现细胞退分化和代谢异常可能是关键生物学事件，同时我们也开发出一系列基础性的基因编辑技术，对更广泛的生物学研究和医学研究提供重要的帮助。