外源基因在衣藻叶绿体中高效表达机制的研究

随着植物叶绿体生物反应器特别是衣藻叶绿体生物反应器的发展，已在表达载体构建技术、载体转化技术、目的蛋白检测技术等方面取得长足进展。但外源基因表达量低下一直是困扰衣藻叶绿体生物反应器商业化的一个瓶颈。衣藻叶绿体基因组测序的完成使解决上述问题成为可能。本课题拟首先克隆衣藻内源性强启动子，在对启动子序列分析的基础上，阐明衣藻叶绿体基因表达调控规律，同时利用序列突变技术构建强启动子。其次综合利用强启动子、增强子、5'编码区、密码子的偏好性等各种调控元件和调控措施来增加外源基因的表达量，从而为衣藻叶绿体生物反应器的商业化应用奠定坚实的基础。.在上述工作的基础上，本研究还拟实现乙肝病毒S基因在衣藻叶绿体中的高效表达，以便检验综合表达调控规律是否具有普遍性，同时也为利用衣藻叶绿体生物反应器生产乙肝疫苗打下基础。

在本研究中，首先克隆了衣藻内源性启动子、增强子、终止子及5’与3’非翻译区等调控序列，在此基础上，构建了含有外源目的基因，衣藻叶绿体同源重组序列及不同调控元件组合的系列衣藻叶绿体表达载体，基因枪法转化衣藻细胞后，经壮观霉素抗性筛选，获得了阳性转化子。分子生物学检测结果表明，利用同源重组策略可将外源目的基因整合到衣藻叶绿体基因组中。转化含有5’及3’chlL同源片段，atpA启动子，(dAAAGGG)8增强子元件及rbcL终止子的调控元件组合能够高效调控乙肝病毒S基因的表达，表达量在所有转化子中是最高的，可占衣藻可溶性总蛋白的2.9%左右。表达的目的蛋白能够引起动物的免疫反应，表明了利用衣藻叶绿体生物反应器生产疫苗的良好前景。