基于生物藕联技术的蛋白修饰对Bt杀虫活性增效机理的研究

Regulation of interaction between Bt insecticidal toxin and pest receptor can play a key role in pest resistance management.In this study, Bt toxin is modified by using bioconjugate technique. The best bioconjugation conditons are evaluated by screening different bioconjugators (zero-length, homotype and heterotype difunctional) and avermectin compounds. After that, the effect of the modification on enhancing Bt insecticidal activities are investigated. Also, How the bioconjugate modifications effect pest insecticide-resistance are studied. We try to interpret the inhibition mechanism of bioconjugated Bt on pest resistance from three points: the localization of BtA (Bt-abamection)in target insect brush border membrane vesicle (BBMV), interaction between BtA and insect receptors and the effet of BtA on expression of receptor protein. This is the first study on insect resistance management mechanism of bioconjugated insecticide, which will be a novel direction for development of new pesticides.

调控Bt的杀虫毒素与害虫受体的相互作用是治理害虫抗药性的关键。本研究利用生物藕联技术修饰Bt毒素，研究修饰后的Bt毒素杀虫活性的增效作用。比较不同藕联方式（零长度、同型和异型双功能藕联剂）及藕联分子的不同构象（阿维菌素系列衍生物）形成的修饰对Bt杀虫活性的影响，确定最优的藕联方法。研究藕联修饰后的Bt毒素对害虫抗药性的影响，尝试从藕联修饰后Bt毒素在抗性害虫中肠BBMV上的定位、与主要受体蛋白的相互作用及受体蛋白表达影响3个方面，阐明藕联产物对害虫抗药性治理的机理。该研究创新性地从生物藕合角度出发，设计新型藕合农药，为新型农药的设计提供新的研究方向，推动我国农药行业的发展。

Cry杀虫蛋白是Bt最主要的杀虫成分。Cry蛋白与昆虫受体的相互作用是提高Bt防效最关键的机理。本研究利用生物藕联技术在蛋白质水平修饰Cry蛋白，提高Cry蛋白与受体的互作，研究增效机理：1）首次克隆并表达了对小菜蛾具有高毒力的新型Bt毒素Cry2Ab杀虫蛋白，经国际Bt命名委员会命名为Cry2Ab30（G1187A和T1402C），作为藕联修饰的靶标Bt蛋白。2）阿维菌素及其衍生物伊维菌素为藕联配基，进行不同的羧基化修饰，比较不同藕联方式及藕联配基的不同构象对Cry2Ab30修饰的效果，其中阿维菌素修饰的效果要优于伊维菌素。藕联修饰提高了Bt毒素与小菜蛾受体的互作，提高了Bt毒素对小菜蛾杀虫毒力。 3）首次鉴定了PxAPN5是Cry2Ab30在小菜蛾中与杀虫毒力相关的功能性受体，其中PxAPN5的Domain 1和Domian 3是与Cry2Ab30的结合区域;钙粘蛋白也是Cry蛋白的关键受体之一，本课题研究发现小菜蛾钙粘蛋白的PxCR10-11是与Cry2Ab30的结合区域，PxCR10-11能提高Cry2Ab30对小菜蛾毒力16.66%。4）利用免疫组化和电镜观察，发现藕联修饰前后的Cry2Ab30都能定位到小菜蛾的中肠，藕联修饰后的Cry2Ab30对小菜蛾中肠上皮微绒毛的损伤更严重。5）利用转录组学分析藕联修饰前后的Cry2Ab30作用小菜蛾后其体内基因表达的差异，共获得52.73 Gb的Clean Data，Q30碱基百分比在91.91%及以上。主要受体（APN,钙粘蛋白，ABCC2等）的基因表达在藕联修饰后均有所提高，结果有待后续的验证与分析。6）藕联型Bt毒素的田间实验表明，藕联修饰能有效的提高Bt毒素对花菜地小菜蛾的防效，效果优于Bt毒素与配基的混合组及Bt毒素与配基单独的作用组。7）在Bt新型杀虫蛋白的挖掘及Cry2Ab30活化机制的探索方面进行了一些拓展性的研究。本课题探索了生物藕联在Bt毒素改造中的应用，并初步阐述了其作用机理，为新型农药的设计提供了新的研究方向。