以革兰氏阴性耐药菌外膜和生物膜为靶点的多功能纳米粒的构建及其抗耐药机制研究

Multidrug resistance of gram-negative bacteria with biofilm to most antimicrobials is an important reason for disillusionary therapy. The latest research shows that D-amino acid inhibits biofilm formation and triggers biofilm disassembly. Besides, previous study indicated that Tat as a membrane penetrating peptide, can act on outer membrane of Pseudomonas aeruginosa thereby decreasing minimum inhibitory concentration of clarithromycin. In our innovative program, Tat is connected to medium chain fatty acid (MCT) possessing further ideal outer membrane targeting capability. Moreover, hydrophilic D-amino acid is covalently linked with DSPE-PEG-OH via an acid cleavable Schiff base bond linker. A novel multi-target nano delivery system composed of Tat-MCT, DSPE-PEG-Schiff base-D amino acid, and a macrolide antibiotic clarithromycin as a model drug, are fabricated, ensuring that D-amino acid can be preferentially released to biofilm with lower pH condition, and subsequently Tat-MCT is released from nanoparticles to outer membrane of gram-negative bacteria improving bactericidal action of clarithromycin. We will evaluate in vitro and in vivo antibacterial as well as antibiofilm efficiency and their mechanism of anti-resistance. The multi-target nanoparticle hasn't been reported at home and abroad. Therefore, the results of research will provide a theoretical and practical basis for multi-target synergistic effect of the constructional multi-target nano delivery system on multidrug resistance of gram-negative bacteria.

针对目前临床上革兰阴性菌普遍产生生物膜、耐药严重、引起持续性感染难以治疗的科学问题，利用D型氨基酸对生物膜的良好抑制与分散作用，结合本课题组前期研究中发现的Tat作用于革兰阴性菌外膜的特点，将Tat与脂肪酸偶联形成具有抗耐药菌活性且可自组装的偶联物，将D型氨基酸通过Schiff碱键与双亲性聚合物DSPE-PEG连接形成pH敏感偶联物，二者共同作为载体包载抗菌药物，构建以革兰阴性耐药菌外膜和生物膜为靶点、具阶梯释药特性的新型多功能纳米给药系统。生物膜表面的低pH促使D型氨基酸优先释放以分散生物膜、暴露细菌，继而释放的Tat-脂肪酸偶联物有效作用于细菌外膜，增强膜通透性，增加抗菌药透过量及抗菌效果。评价该体系体内外抗菌和抗生物膜效果，探索其抗革兰阴性耐药菌及抗生物膜的作用机制。本项目构建的体系在国内外均未见报道，其研究结果将为纳米递送系统实现多靶点协同抗革兰阴性耐药菌提供理论依据和实践基础。

全球范围内耐药菌感染形势日趋严峻，给细菌感染尤其革兰氏阴性耐药菌感染相关疾病治疗带来极大困难，已严重危害了患者的生命健康。针对目前临床上革兰氏阴性菌普遍产生生物膜、耐药严重、引起持续性感染难以治疗的科学问题，本项目利用前期工作中发现的细胞穿透肽Tat作用于革兰氏阴性菌外膜的特点，将Tat与脂肪酸偶联形成具有抗耐药菌活性且可自组装的偶联物（Tat-Cn），并利用D型氨基酸对生物膜的良好抑制与分散作用，将D型氨基酸通过Schiff碱键与双亲性聚合物DSPE-PEG连接形成pH敏感偶联物（DSPE-PEG-DTAA），以二种偶联物共同作为载体包载抗菌药物，构建以革兰氏阴性耐药菌外膜和细菌生物膜为靶点、具有pH敏感性梯度释药特征的新型多功能纳米给药系统。评价该多功能纳米给药系统的体外药学特征、体内外抗菌和抗生物膜效果，探索其抗革兰氏阴性耐药菌及抗生物膜的作用机制。.研究结果显示，所构建的载克拉霉素多功能纳米粒体外药学性质优良；体外抗革兰氏阴性耐药铜绿假单胞菌及抗生物膜效果显著；对耐药铜绿假单胞菌所致小鼠皮肤脓肿和肺部感染具有显著治疗作用；血液相容性良好，皮下注射和滴鼻给药后皮肤和肺部的组织相容性良好。该多功能纳米粒抗革兰氏阴性耐药菌机制可能为：广泛作用于耐药菌内外膜，产生去极化作用，导致细菌内外膜屏障被破坏，促进抗菌药的渗透和发挥杀菌作用。抗革兰氏阴性菌生物膜耐药机制可能为：降低耐药菌生物膜中胞外多糖（EPS）和胞外DNA（eDNA）表达量，破坏生物膜形成的物质和结构基础；改变细菌表面，降低细菌表面疏水性，从而降低细菌聚集能力和群集运动能力；降低细菌的重要毒力因子—绿脓菌素和鼠李糖脂的表达量。.本项目构建的多功能纳米体系在国内外均未见报道，其研究在理论方面，有望为纳米给药系统抗耐药，载体材料与抗菌药物有机结合抗耐药，以及抗耐药菌与抗生物膜相结合、多作用靶点协同作用的方式抗耐药做出初步的有益探索，提供一种新思路和新方法；从应用方面，有望利用所构建的两种兼具抗菌和抗生物膜活性的纳米载体材料开发出一种具有普遍适用性的抗耐药菌纳米给药系统，包载各种不同的抗生素或其它抗菌活性物质，用于耐药菌尤其是革兰氏阴性耐药菌感染的治疗。