基于转录组测序的高密度SNP遗传图谱的构建及抗病相关QTL分析——以黄鳝为例

分子标记辅助育种需要高密度的遗传连锁图谱。目前连锁图谱普遍存在两个问题，一是标记的密度不够，二是与基因连锁的Ⅰ型标记太少。连锁图谱的一般做法是先获得标记，再检测标记的适用性。但是，由于标记开发时所用的个体和图谱构建时的亲本不同，导致很多位点由于在亲本中不能扩增或亲本间没有多态性而被弃之不用，造成极大的浪费。为克服这一障碍，本研究采用家系和标记直接对应的方法构建连锁图谱：即以F1家系为亲本，单对交配产生的F2家系为作图群体，采用高通量测序技术获得F1亲本转录组序列的SNP位点，直接以这些位点进行遗传图的构建。同时，对F2子代进行抗病性（抗温和气单胞菌）分析，鉴定相关QTL。由于所得SNP均来自于基因，因而通过比较基因组的方法，可对QTL位点进行同线性分析，找出这些区域可能包括的基因，并从转录组测序结果中鉴定这些基因所包含的SNP位点，对这些位点进行关联分析，从而进一步缩小QTL的范围。

分子标记辅助育种需要高质量的遗传连锁图谱。目前关于黄鳝的遗传图谱未见报道，相应的高通量转录组数据也不足。本研究旨在通过高通量转录组研究获得大量SNP位点，并对这些位点进行连锁分析，以期构建SNP连锁图谱。为获得全同胞家系，我们使用一次性注射LRH-A5对亲鳝进行人工催熟。研究发现，LRH-A5的用量在0.25-0.5ug/g之间，能取得较好的催产效果。通过此法，构建了4个全同胞家系，每个家系70-90个体，然而后期饲养和病害原因，使得大量个体死亡，存活的每个家系仅40余条，这为图谱的构建造成了很大困难，为此我们试着用单精子基因组分析法来弥补这一缺陷，目前，单精子PCR扩增基因组正在进行。为获得转录组SNP数据，我们使用对不同组织RNA样本进行了转录组测序，获得了39470302个reads。从头组装后共获得unigenes 125263个，平均长度1.6kb。GO分析将黄鳝unigene划分为60个功能组，132695个unigenes归属于细胞组分，62886个unigenes归属于分子功能，204696个unigenes归属于生物学过程。KEGG分析共定位了316个具体的代谢途径分支。其中，涉及代谢途径的unigenes占9.78％；癌症unigenes占4.33%；MAPK信号通路unigenes占3.82%。转录组测序后分析，共获得SSR位点43867个，其中单碱基重复最多，占42.3%，之后是双碱基和三碱基重复，分别占28.7%和25.6%。SNP分析共获得397156个SNP位点，其中转换占68.18%，颠换占31.82%。.为获得更多的SNP和SSR位点，对全基因组进行了RDA测序， 共获得1853万条reads。MISA软件分析共获得27407个SSR位点。根据获得的SSR位点，设计了220对引物，对黄鳝基因组进行扩增，得到139对扩增良好的引物。对通过转录组测序和RDA测序获得的SNP位点设计引物，共设计了657个引物，其中322条引物可以扩增出单一条带。HMR分析展示了其在群体中良好的多态性。.此外，克隆了IRAK-4、NF-k-B、IL-1β、IRF等免疫相关基因，用嗜水气单胞菌感染黄鳝，确定感染前后相关基因的表达变化，这些基因大多在感染后大量表达，这与其发挥非特异性 免疫的机制是一致的。对于这些基因的作用机制研究目前正在进行。