基于多重DNA链置换探针的ctDNA高通量检测平台构建及对前列腺癌转移预测价值研究

Accurate prediction of metastatic prostate cancer is of great significance to the prognosis. Plasma ctDNA mutation can be used as a non-invasive marker for early metastasis prediction in prostate cancer. Pre-experiment shows that the combination of multiplex ctDNA mutations is effective in the prediction of metastatic prostate cancer, performing better efficacy than the single gene prediction analysis model. However, clinically appropriate high-throughput detection methods for multiplex ctDNA mutations is still urgently needed. Based on the preliminary experiments, we aim to amplify target ctDNAs by multiplex PCR and achieve high-throughput and high-specificity detection of ctDNA mutations by multiplex DNA strand displacement probes under optimized conditions. Plasma samples from prostate cancer patients are used for ctDNA mutations detection, and prediction analysis model based on multiplex ctDNA mutations is constructed to evaluate its early predictive efficacy for metastatic prostate cancer. This study is expected to provide an effective non-invasive technology platform for the early prediction of metastatic prostate cancer.

前列腺癌患者转移的精确预测对治疗及预后具有重要意义。血清ctDNA突变可作为前列腺癌转移预测潜在无创标志物。预实验结果表明基于血清ctDNA突变的多基因联合预测模型对前列腺癌患者转移具有良好的预测效能，显著优于单基因预测模型。但开发临床适宜的多重血清ctDNA突变高通量检测平台仍是目前亟待解决的科学问题。本课题拟在前期预实验基础上，利用多重PCR技术扩增目的ctDNA，并通过自主构建的多重DNA链置换探针实现ctDNA突变的高通量、高特异检测，优化条件并评价有效性及检测性能；收集前列腺癌患者血清标本并检测ctDNA突变，构建前列腺癌转移多基因联合预测模型，评价其对前列腺癌患者转移预测效能及预后监测价值。通过本课题研究有望为前列腺癌患者转移的精确预测提供有效的无创技术平台。

前列腺癌患者转移早期的精确预测对治疗及预后都具有重要意义。开发高敏、特异的无创标志物对前列腺癌转移预测具有重要价值。本项目自主构建Toehold标记引物（Toehold-primer），利用多重PCR技术扩增血浆ctDNA，优化toehold长度并评价有效性；根据基因突变特征，设计针对AR、ATM、SPOP、RB1及TP53突变基因的DNA链置换探针，优化探针序列及反应条件，建立针对ctDNA高通量检测平台并评价其有效性。研究结果显示构建多重链置换探针交叉反应较低，检测限均低于0.001amol，可作为多基因ctDNA检测的有效技术手段。研究中由于前列腺癌转移早期血浆ctDNA丰度较低，自主构建的多重链置换探针不能完全满足临床灵敏度要求。但在深入研究后发现，ctDNA的片段末端特征与正常细胞释放游离DNA有明显差异，因此我们进一步构建“末端特异性富集技术”实现ctDNA的靶向预富集，有潜力作为ctDNA高敏检测的有效辅助手段。由于ctDNA丰度较低，研究中我们进一步对前列腺癌尿液外泌体进行检测，发现尿液EpCAM-CD9阳性细胞外囊泡在前列腺癌患者中显著升高，可作为前列腺癌无创诊断的标志物。本课题结果具有较强的应用潜力，可为前列腺癌发生发展的精确预警提供强有力的技术支撑。