Pin1激活p53线粒体转位在热打击诱导血管内皮细胞凋亡中的分子机制

Our preliminary study has revealed that heat stress-induced VEC cell apoptosis is associated with translocation of p53 to mitochondria induced by ROS(Transcription-independent p53 apoptosis). Previous studies have suggested that: 1. One important post-translational modification regulating mitochondrial translocation of p53 is monoubiquitination.2. through isomerization of phosphorylated p53, Pin1 promotes its ubiquitylation. Based on these studies, we presumed that pin1 regulate Mitochondrial p53 Translocation during ROS-p53 transcription-independent apoptosis activated by heat stress. Using overexpression or RNAi technique to up- or down-regulate pin1 expression and point mutation directly to block nuclei expression of p53 and the binding-site of p53 and pin1,as well as MnTBAP to block ROS signal transduction, also with pin1 and p53 gene knock out mice, The objective of this study was to analyze The molecular mechanism of Mitochondrial p53 Translocation activated by pin1 during heat stress induced endothelial cell apoptosis. So that we can profound understanding of the mechanism of endothelial dysfunction induced by heat stress and hope to reduce the mortality and morbidity of heatstroke.

我们前期研究发现，在热打击诱导VEC细胞凋亡中，ROS通过诱导p53快速线粒体转位激活线粒体凋亡信号（p53转录非依赖信号）。既往研究表明:1、p53转录后单泛素化修饰反应是其线粒体转位的关键；2、Pin1可通过特异性结合p53磷酸化位点，调控p53泛素化修饰反应。由此假设，在热打击诱导ROS-p53转录非依赖凋亡信号中，Pin1作为中间环节调控p53线粒体转位。利用过表达和RNAi上调和下调pin1表达、直接位点突变方式阻断p53核表达以及p53与Pin1的结合位点、MnTBAP阻断ROS信号传导，采用Pin1和p53基因敲除鼠，从动物和细胞水平，正反两方面阐明热打击诱导内皮细胞损伤中，ROS通过中间环节Pin1激活p53转录非依赖信号的分子机制。项目研究有助于深刻认识中暑热打击早期血管病变的作用机制，为临床有针对性预防中暑热打击病情进展以降低死亡率和后遗症发生率提供实验依据。

研究背景和目的：. 前期研究发现，在热打击诱导血管内皮细胞损伤中，ROS 通过诱导 p53 快速线粒体转位激活了线粒凋亡信号（p53转录非依赖信号）。既往研究表明，Pin1可以通过特异性结合 p53 磷酸化位点而调控 p53 的功能。基于此，本研究拟探讨 Pin1 作为 ROS 和 p53 转录非依赖凋亡信号的中间环节在热打击后血管内皮细胞凋亡中的重要作用，为揭示热打击血管内皮细胞损伤的机制和临床重症中暑的防治提供实验依据。.主要研究结果：.1. 热打击通过 p53 转录非依赖信号诱导血管内皮细胞凋亡. 热打击后MAEC p53+/+ 和 MAEC p53NLS 细胞中 p53 迅速移位至线粒体，继而激活线粒体凋亡信号，诱导细胞广泛凋亡。进一步通过体内实验研究发现热打击野生型小鼠可诱导主动脉内皮组织细胞 p53 移位至线粒体并激活了线粒体凋亡通路，而热打击 p53KO小鼠显示线粒体凋亡通路被明显抑制。.2. Pin1 通过与 p53 Ser46 磷酸化位点结合调控热打击后 p53 转录非依赖信号. 热打击诱导了 p53 Ser 46 磷酸化，血管内皮组织和细胞中 Pin1 表达和活性增高，且与 p53 存在相互作用。MAEC p53+/+细胞过表达或干扰 Pin1，可以促进或抑制热打击后 p53 的线粒体转位。使用 Pin1 抑制剂 Juglone预处理野生型小鼠，可明显抑制热打击后 p53 转录非依赖信号介导的内皮组织细胞凋亡。此外，热打击激活了 H1299 p53NLS 细胞（H1299 p53-/- 细胞转染 p53 核输入位点突变体质粒）p53 转录非依赖信号，与热打击后血管内皮细胞凋亡通路激活存在一致性；H1299 p53NLS细胞单一突变p53 Ser46磷酸化位点，可以抑制热打击后p53转录非依赖信号，即使过表达 Pin1 也不能发挥其介导的 p53 促凋亡作用。.3. ROS 作为上游信号参与热打击后 Pin1/p53 转录非依赖途径介导的血管内皮. 细胞凋亡热打击诱导了 MAEC p53+/+细胞线粒体 ROS（O2-˙）升高以及主动脉内皮组织的氧化应激反应，MAEC p53+/+细胞过表达 MnSOD 或使用 O2-˙抑制剂MnTBAP 预处理动物后，可以抑制热打击诱导 Pin1 的表达活化、p53 线粒体转位以及线粒体凋亡信号。