克雷伯氏肺炎杆菌1,3-丙二醇合成途径反应动力学研究

生物法生产1,3-丙二醇中，1,3-丙二醇产生速率、中间代谢产物3-羟基丙醛浓度以及底物转化率等关键技术指标都由代谢途径的动力学特性决定。但是由于途径中酶促反应存在底物和产物抑制、双底物和可逆等特性，使得动力学模型结构复杂，不易求解，目前的研究还很不完善。本研究旨在通过体外酶促反应实验，结合线性回归和非线性回归方法，从简化模型到完整模型，逐步确定克雷伯氏肺炎杆菌1,3-丙二醇合成途径中四个酶的反应动力学特征参数。在此基础上通过酶活性抑制实验，在各模型中添加3-羟基丙醛抑制项。然后建立途径总体动力学模型，综合考虑多因素对代谢结果的影响，对1,3-丙二醇合成途径代谢规律进行准确定量描述。进一步通过发酵实验，探明不同培养条件和不同发酵阶段胞内1,3-丙二醇合成途径的代谢规律，确定胞内1,3-丙二醇生成的限制性因素以及3-羟基丙醛积累的调控因素，为发酵过程调控和菌株改造提供理论指导。

本项目主要就克雷伯氏肺炎杆菌1,3-丙二醇合成途径中相关酶的动力学性质以及在1,3-丙二醇合成中的作用进行了研究。在克雷伯氏肺炎杆菌中建立了一种基于Red重组酶辅助的利用短同源臂外加保护序列的基因重组方法。克隆并异源表达了1,3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱氢酶、甘油脱水酶、二羟基丙酮激酶I和二羟基丙酮激酶II。利用一种双底物双产物可逆反应模型对甘油脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的动力学性质进行了模拟，结合线性回归和非线性回归方法对模型的参数进行了求解。利用建立的同源重组技术对染色体上基因进行敲除获得二羟基丙酮激酶I和II基因突变体，结合两个基因在大肠杆菌中的异源表达对这两个同功酶在1,3-丙二醇合成途径的作用进行了研究，初步确定二羟基丙酮激酶II的作用远大于二羟基丙酮激酶I的作用。