恶臭假单胞菌KT2440中c-di-GMP合成酶WspR上游转录调节子的筛选和功能探究

Cyclic di-GMP (c-di-GMP) is a ubiquitous bacterial secondary messenger that involved in a diverse range of cellular processes including biofilm formation. Synthesize of c-di-GMP is done by diguanylate cyclase (DGC) enzymes. WspR is a conserved DGC in Pseudomonas species, which plays a vital role in regulating biofilm formation. Function mechanism of WspR has been widely studied, but transcriptional regulation of wspR remains poorly understood. In previous studies, we discovered the mechanism by which WspR regulating biofilm formation in Pseudomonas putida KT2440, and we also found that transcription of wspR showed an obvious decrease in RpoS mutant. In this study, role of RpoS in transcription of wspR will be further confirmed by 5’RACE and in vitro transcription assay. Meanwhile, this work attempts to screen and characterize the regulators that control wspR transcription using bacteria one-hybrid system and electrophoretic mobility shift assay. Further research about the influence of target regulators on expression of wspR, intracellular c-di-GMP levels and biofilm formation will also be performed. The results of this study will be useful in elucidating the regulation mechanisms of c-di-GMP level and biofilm formation in P. putida, meanwhile, it will deeper our understanding on regulatory pathways based on c-di-GMP.

环二鸟苷酸(c-di-GMP)是细菌中普遍存在的核苷类第二信使，参与调控生物被膜形成等生理活动。WspR是假单胞菌中保守的c-di-GMP合成酶，在c-di-GMP介导的对生物被膜的调控中起关键作用。WspR的功能和作用机制已有广泛研究，但对于其转录调控知之甚少。申请人前期揭示了恶臭假单胞菌KT2440中WspR调控生物被膜形成的机制，且发现缺失sigma因子RpoS导致wspR转录显著下降。在此基础上，本项目将利用5’RACE和体外转录等手段深入探究RpoS在wspR转录调控中的作用和机制；同时运用细菌单杂交和凝胶迁移阻滞技术在基因组范围内筛选WspR上游的转录调节子，并解析其对wspR表达、胞内c-di-GMP水平及生物被膜形成的影响和作用机制。研究结果将为揭示假单胞菌调控c-di-GMP水平及生物被膜形成的机理奠定基础，并拓展对以c-di-GMP为核心的调控通路的全面认识。

第二信使环二鸟苷酸(c-di-GMP)在细菌生物被膜形成的调控中起主导作用。WspR是假单胞菌中一个保守的c-di-GMP合成酶，对胞内c-di-GMP水平维持和生物被膜形成至关重要。恶臭假单胞菌KT2440是一种具有复杂的代谢多样性和对不同环境强适应性的菌株，被广泛用于基础研究和工业生产实践。本项目以恶臭假单胞菌KT2440为研究对象，探究了WspR所在的wsp操纵子中基因表达及共转录的情况，发现wsp操纵子中的7个基因是共转录的，同时发现操纵子中存在6个启动子，并按照所处位置将其分别命名为wspA启动子(wspApro)，wspB启动子(wspBpro)，wspC启动子(wspCpro)，wspD启动子(wspDpro)，wspF启动子(wspFpro)，和wspR启动子(wspRpro)，其中位于操纵子最前端的wspApro活性最强。我们利用细菌单杂交技术和启动子报告载体检测了恶臭假单胞菌中24个sigma因子对wsp操纵子中各启动子活性的影响，发现sigma因子RpoS正调控wspApro和wspFpro的活性，SigX正调控wspRpro的活性，而RpoN正调控wspCpro的活性。序列分析发现wspApro中存在RpoS识别的保守序列，体外实验表明RpoS直接结合wspApro中的保守序列，且rpoS缺失导致wsp操纵子表达下降。信号响应方面，通过基因表达分析和生物被膜检测分析发现，RpoS和SigX分别响应四环素和蔗糖提高wspApro和wspRpro的活性，进而提高c-di-GMP水平，造成生物被膜形成能力增强。此外，本项目构建了包含360个调节子的恶臭假单胞菌调节子表达库，并利用细菌单杂交和体外凝胶阻滞实验筛选得到6个能特异性结合wspR启动子(wspRpro)的转录调节子，包括PP_0271，PP_1012，PP_1637，PP_4107，PP_4467，PP_5680。通过构建调节子缺失突变体并检测表型，初步确定了上述6个调节子对wspRpro活性、c-di-GMP水平及生物被膜形成的影响。本项目的结果拓展了对wsp操纵子转录调控的认识，揭示了四环素和蔗糖促进恶臭假单胞菌生物被膜形成的机制，为深入解析Wsp系统介导的c-di-GMP信号调节网络奠定了基础。